Folosind transferul de energie prin rezonanță de fluorescență in vitro pentru a studia dinamica complexelor proteice la

rezumat

Interacțiunile proteină-proteină sunt esențiale pentru sistemele biologice, iar studiile de cinetică de legare oferă o perspectivă asupra dinamicii și funcției complexelor proteice. Descriem o metodă care cuantifică parametrii cinetici ai unui complex proteic folosind transferul de energie prin rezonanță de fluorescență și tehnica fluxului oprit.

Abstract

Introducere

Activitatea biologică este realizată în cele din urmă de proteine, dintre care cele mai multe interacționează cu altele pentru funcții biologice adecvate. Folosind o abordare de calcul, cantitatea totală de interacțiuni proteină-proteină la om este proiectată să fie de 650.000

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Descărcați fișierul de structură al complexului Cul1 • Cand1 din Protein Data Bank (fișierul 1U6G).
Arată structura complexului în PyMOL Cul1 • Cand1.
Funcția de măsurare din meniu " Asistenți "din PyMOL pentru a estima distanța dintre primul aminoacid al Cand1 și ultimul aminoacid al Cul1 (Figura 1).
Descărcați vizualizatorul de spectre online (consultați Tabel de materiale) și afișează spectrele de excitație și emisie ale 7-amino-4-metilcumarinei (AMC) și clipesc simultan (Figura 2). Rețineți că AMC este donatorul de fret și Blitz este acceptorul de fret.

Figura 1: Structura cristalină a Cul1 • Cand1 și măsurarea distanței dintre potențialele site-uri de etichetare. Fișierul cu structură cristalină a fost descărcat din Protein Data Bank (fișierul 1U6G) și vizualizat în PyMOL. Măsurătorile între atomii selectați au fost efectuate de PyMOL. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Figura 2: spectrele de excitație și emisie ale coloranților fluorescenți pentru Bund. Sunt afișate spectrele AMC (7-amino-4-metilcumarină) și FlAsH. Liniile punctate prezintă spectre de excitație, iar liniile solide arată spectre de emisie. Imaginea a fost generată inițial de fluorescența SpectraViewer și a fost modificată pentru o mai bună claritate. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

2. Prepararea AMC Cul1 • Rbx1, proteină donatoare FRET

Construiți plasmide pentru exprimarea sortazei Cul1 umane • Rbx1 în celulele E. Coli. Rețineți că cele două plasmide Co care exprimă Cul1 • Rbx1 uman în celulele E. Coli sunt descrise în detaliu într-un raport anterior 20.
1. Adăugați o secvență ADN care codifică „LPETGGHHHHHH” (Sortază, seine6 day) la capătul 3 'al secvenței de codificare Cul1 prin PCR standard și metode de clonare 21, 22 .
2. Secvențați noua plasmidă pentru a confirma corectitudinea inserției genetice.
Co Express Cul1 Sortază • Rbx1 în celulele E. Coli. Metoda este derivată dintr-un raport anterior 20.
1. Se amestecă 100 ng din două plasmide cu celule BL21 (DE3) chimic competente pentru co-transformare folosind metoda Heat Shock 23. Creșteți celulele pe placa de agar LB cu 100 µg/mL ampicilină și 34 µg/mL cloramfenicol la 37 ° C peste noapte.
2. Se inoculează 50 ml de cultură LB cu colonii proaspăt transformate și se dezvoltă peste noapte la 37 ° C, agitând cu 250 rpm. Acest lucru oferă o cultură de început.
3. Se inoculează 6 sticle, fiecare cu 1 L LB mediu cu 5 mL de cultură inițială, fiecare și se dezvoltă la 37 ° C cu 250 rpm agitare până la OD600
  
  3. Pregătiți Flash-Cand1, proteina acceptor Bund
  
  Notă: Majoritatea pașilor din această parte sunt identici cu Pasul 2. Condițiile care diferă sunt descrise în detaliu mai jos.
  
  40 µM prin transferarea tamponului printr-o ultrafiltrare a membranei (limită de 30 kDa). Se estimează concentrația proteinei folosind absorbanța la 280 nm. Salvați proteina ca alicote de 50 µL la -80 ° C.
  Notă: Protocolul poate fi întrerupt aici.
Crearea Flash Cand1.
1. Adăugați soluție flash 1 µL (a se vedea Tabel de materiale) la 50 µL soluție TetraCys Cand1.
2. Se amestecă bine și se incubează amestecul la temperatura camerei în întuneric timp de 1-2 ore la FlAsH Cand1.
  Notă: Protocolul poate fi întrerupt aici.

4. Pregătiți Cand1, proteina Bund Chase

NOTĂ: Protocolul de preparare a proteinelor este similar cu pasul 3 cu următoarele modificări.

Introduceți secvența de codare a Cand1 de lungime de seară în vectorul pGEX-4 t-2.
Schimbați tamponul utilizat la pasul 3.3.5 într-un tampon care conține 30 mM Tris-HCI, 100 mM NaCl, 1 mM DVB-t, 10% glicerol.
Eliminați pașii 3.3.7 și 3.3.8.

5. Testați și confirmați testul Bund

6. Măsurați uniunea constantei ratei (cumpărați) a Cul1 • Cand1

NOTĂ: Detaliile privind funcționarea unui fluorimetru cu flux oprit au fost descrise într-un raport anterior 26.

7. Măsurați constanta ratei de disociere (koff) a Cul1 • Cand1 în prezența Skp1 • Proteina F-box.

Notă: Acest pas este similar cu pasul 6 cu următoarele modificări.

În seringa A, sub poziție a umple, Încărcați o soluție de 100 nM Cul1 AMC • Rbx1 și 100 nM FlAsH Cand1 în pachetul de tampon. Rotiți exemplul poziției „DRIVE”.
Încărcați în seringa B sub poziție a umple, o soluție de Skp1 • Skp2 (pregătită conform unui raport anterior 20). Rotiți exemplul poziției „DRIVE”.
Deschide asta Panou de control sub dobândi în software și înregistrați emisia programului Cul1 AMC peste 30 de secunde. Apoi, faceți o singură lovitură. Semnalele fluorescente cresc în timp după amestecarea soluțiilor A seringă și seringă B (Figura 5).

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Figura 3: Test reprezentativ Bund pentru Cul1 • Formarea complexului Cand1. Probele din grămada de tampon (30 mM Tris-HCI, 100 mM NaCl, 0,5 mM DVB-t, 1 mg/mL ovalbumină, pH 7,6) au fost entuziaste la 350 nm și emisiile au fost scanate de la 400 nm la 650 nm. (A) Spectre de emisie de 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 (complet) și un amestec al ambelor (FRET). Cand1 (complet) înseamnă Cand1 complet. (B) Spectre de emisie de 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1 și un amestec al ambelor (FRET). Cand1 cu prima sa helică ștearsă a fost folosit în acest experiment și ulterior. (C) Spectre de emisie Chase de la 70 nM Cul1 AMC, 70 nM FlAsH Cand1, un amestec de ambele (FRET) și control pentru Bund (Chase). Proba Chase conținea 70 nM Cul1 AMC, 700 nM Cand1 și 70 nM FlAsH Cand1. (D) Spectre de emisie de 70 nM Cul1 AMC, un amestec de 70 nM Cul1 AMC și 70 nM FlAsH Cand1 (Bund) și 700 nM Skp1 • Skp2 adăugat la complexul 70 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1. În fiecare grafic, semnalele de emisie au fost normalizate la emisia de 70 nM Cul1 AMC la 450 nm. Vă rugăm să faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei cifre.

Pentru a măsura achiziționarea Cul1 • Cand1 folosind testul FRET stabilit prin reducerea semnalului codificatorului în timp pe monitorul fluorimetru cu flux oprit, am testat mai întâi și am determinat concentrația de proteină care trebuie utilizată. Când s-au folosit 5 nM de Cul1 AMC și FlAsH Cand1, s-a observat o schimbare foarte mică a semnalului (Fig. 4A) întrucât atunci când concentrația fiecărei proteine a fost crescută la 50 nM, s-a observat reducerea semnalului în timp (Figura 4b) și această modificare a fost abolită atunci când tampoanele fără FlAsH Cand1 (Figura 4) a fost adăugat. Prin urmare, 50 nM Cul1 AMC a fost utilizat pentru analize suplimentare și un număr de constante de rată de asociere observate (kObs) au fost măsurate prin amestecarea 50 nM Cul1 AMC cu concentrații crescânde de FlAsH Cand1. KObs pentru fiecare experiment a fost calculat prin încorporarea referințelor la o curbă exponențială, iar kObs obținuți din aceeași concentrație de FlAsH Cand1 au fost mediate. Graficul kObs mediu cu concentrația Cand1 și o regresie liniară (Figura 4) efectuați, achiziția a fost determinată 7.27 .

Figura 4: Măsurarea reprezentativă a constantei de viteză a clubului. (A) fluorescența de 5 nM Cul1 AMC a fost monitorizată de un fluorimetru cu flux oprit în timp după adăugarea a 5 nM FlAsH Cand1. (B) fluorescența 50 nM Cul1 AMC a fost monitorizată de un fluorimetru cu flux oprit în timp după adăugarea 50 nM FlAsH Cand1. (C) fluorescența de 50 nM Cul1 AMC a fost monitorizată de un fluorimetru cu flux oprit în timp după adăugarea tamponului Bund. (D) cumpărați pentru obligațiunea Cand1 către Cul1. k-Obs de Cul1 • Cand1 la diferite concentrații de Cand1 sunt afișate. Panta liniară oferă cumpărare 1,8 x 10 7 M -1 s -1. Pentru a afișa bare de eroare ± SEM; n = 4. Toate probele au fost preparate în tampon de grămadă și excitate la 350 nm. A fost utilizat un filtru bandpass pentru a colecta semnale de la AMC și a exclude semnale de trăsnet. Nu s-au normalizat date. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Similar cu măsurarea achiziției, am măsurat disocierea constantă a ratei observate a Cul1 • Cand1 monitorizând creșterea (recuperarea) semnalului donator în timp pe fluorimetrul cu flux oprit. Cul1 AMC și FlAsH Cand1 au fost amestecate mai întâi și apoi Skp1 • Skp2 a fost adăugat la Cul1 AMC • FlAsH Cand1 pre-asamblat pe fluorimetrul cu flux oprit. Semnalul codificatorului crește rapid și dezvăluie un kObs de 0,4 s -1 (Figura 5). În contrast, când tamponul a fost adăugat la Cul1 AMC • FlAsH Cand1 pre-asamblat, nu s-a observat o creștere a semnalului, sugerând disocierea rapidă a Cul1 • Cand1 a fost declanșat de Skp1 • Skp2.

Figura 5: Măsurarea reprezentativă a constantei ratei de disociere. Modificarea fluorescenței donatorului în comparație cu timpul a fost măsurată după adăugarea 150 nM Skp1 • Skp2 sau tampon Bund la 50 nM Cul1 AMC • FlAsH Cand1 complex. Schimbările de semnal au fost adaptate la o curbă exponențială și există o constantă a ratei de disociere observată 0,4 s -1. Condițiile experimentale au fost similare cu cele din Figura 4descris. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Deoarece fretul este sensibil și cantitativ, a devenit un instrument important pentru studierea interacțiunii dintre macromolecule. Acest protocol oferă un exemplu de utilizare a fretului pentru a studia dinamica complexului proteic în soluție. Bund a fost, de asemenea, utilizat împreună cu imagistica cu celule vii pentru a studia interacțiunile moleculare în celulele vii 36, care este puternic în dezvăluirea dinamicii complexelor proteice în condiții fiziologice. În plus, fretul poate fi utilizat și la nivelul unei singure molecule, studiind dinamica în timp real a complexelor macromoleculare 37, 38, studiind perspective asupra schimbării conformaționale a complexului. Pentru a îmbunătăți eficiența și detectarea fretului, sunt de mare interes fluoroforii și biosenzorii cu luminozitate și fotostabilitate, care sunt dezvoltate și studiate activ 28, 39 .

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.