Glicoproteine umane din culturi de celule animale - spectrul științei
Glicoproteine umane din culturi de celule animale
Contextul medical
Structura ligandului P-selectină este cunoscută. Pe „coloana vertebrală” a proteinei, lanțul de aminoacizi, cinci molecule de zahăr (și anume fucoză, galactoză, N-acetil-galactozamină, N-glucozamină și acid neuraminic) sunt dispuse într-o anumită configurație pe un aminoacid. Pentru a îmbunătăți șansele de succes ale proiectului nostru, am urmărit două strategii diferite: În cazul căii in-vitro, în afara organismului viu, structura zahărului este construită pe o peptidă de enzime speciale, glicozil transferazele. Majoritatea enzimelor necesare pentru aceasta nu sunt disponibile comercial. Acestea trebuie produse biotehnologic. În acest scop, informațiile genetice pentru o glicozil transferază umană sunt introduse într-o celulă CHO. Gena glicoziltransferazei este legată de o secvență semnal care determină celula să secrete transferaza. Aceste celule sunt apoi multiplicate și utilizate în culturi celulare pentru producerea glicozil transferazelor. În etapa următoare, enzimele obținute în acest mod sunt utilizate pentru a construi structura zahărului ligandului P-selectină. În cele din urmă, aranjarea corectă a moleculelor de zahăr poate fi verificată cu ajutorul spectrometriei de masă.
În ruta in vivo, în interiorul celulei vii, informațiile genetice pentru diferite glicoziltransferaze umane și informațiile genetice pentru proteina care trebuie glicozilată sunt introduse într-o singură celulă CHO. Genele glicozil transferazelor nu sunt prevăzute cu o secvență semnal de această dată. Aceasta localizează transferazele din aparatul Golgi, un organet celular (care este responsabil pentru condensarea și acoperirea secrețiilor). Gena proteinei este precedată de o secvență semnal. Este astfel „preprogramat” pentru descărcare și, la ieșirea din celulă, trece prin aparatul Golgi. Glicozil transferazele așteaptă deja aici pentru a transfera moleculele de zahăr în proteină. Avantajul acestei strategii este că celula secretă un ligand P-selectin biologic activ. Cu toate acestea, dificultatea constă în a aranja aceste diferite glicoziltransferaze în raportul corect între ele în aparatul Golgi.
Rezultatele cercetării
Folosind metoda in vitro, am reușit să producem biotehnologic cinci glicoziltransferaze diferite. Cu aceste enzime am sintetizat o structură de zahăr care este foarte asemănătoare cu structura țintă. Trebuie adăugată doar o singură moleculă de zahăr - iar glicozil transferaza necesară pentru aceasta este disponibilă comercial. O linie celulară ar trebui să fie produsă pe calea in vivo care exprimă ligandul P-selectin uman într-o formă activă biologic. După doi ani de cercetări de inginerie genetică, acum avem mai multe linii celulare care îndeplinesc această cerință. Producția de proteine țintă în bioreactoare a început deja.
Datorită colaborării excelente dintre grupurile de cercetare din cinci țări europene, a fost posibilă gruparea cunoștințelor biotehnologice distribuite în întreaga Europă și realizarea obiectivului proiectului. Pe lângă Institutul de biotehnologie de la Forschungszentrum Jülich, au fost implicați și Institutul de fiziologie de la Universitatea din Zurich, Școala de stomatologie de la Universitatea din Copenhaga, Institutul de tehnologie enzimatică de la Universitatea din Düsseldorf, Departamentul de chimie bioorganică de la Universitatea din Utrecht și Institutul de glicobiologie de la Universitatea din Oxford. . Împreună am făcut primii pași de succes pentru a pune la dispoziție o proteină de interes terapeutic ridicat. Următoarele cifre arată cât de mare este acest interes: Din cele 350 de medicamente modificate genetic care sunt în prezent testate clinic în SUA, doar zece sunt destinate tratamentului simptomelor septice.