Identificarea proteinelor cu activitate kinazică - Om - Aliment - Mediu
principiu
Matrice Fosfo-MAPK umană și Matrice -RTK pentru determinarea nivelurilor relative de fosforilare a protein kinazelor activate de mitogen (MAPK), tirozin kinazelor (RTK) și a altor serine/treonină kinazei
Printre cascadele de transducție a semnalului intracelular, kinazele mitogenului sunt activate
Set de matrice Fosfo-MAPK uman pentru detectarea mai multor kinaze fosforilate în celulele tratate, precum și celulele netratate.
Familia proteinelor kinazice (MAPK) joacă un rol central. Familia MAPK combină o serie de kinase serină/treonină, cum ar fi ERK-1 (p44MAPK), ERK-2 (p42MAPK), kinazele N-terminale Jun și p38-MAPK. Stimularea celulei de ex. Factorii mitogeni conduc de obicei la o creștere a activității kinazei MAP. ERK-1 și -2 de ex. apoi se translocează în nucleul celular și activează factorii de transcripție, ceea ce duce ulterior la proliferarea celulelor sau diferențierea celulară, în timp ce o inhibare a MAPK inhibă aceste procese. Odată cu activarea constitutivă a acestor kinaze, poate apărea creșterea necontrolată a celulelor, care joacă un rol important în tumorigeneză. De asemenea, creșterea activității ERK este asociată cu creșterea potențialului tumoral de invazivitate și metastază.
Aceste kinaze pot fi activate de diverși liganzi ai receptorului, prin care mecanismul activării ERK1/2 mediat de receptorul tirozin kinazei este bine caracterizat. Tirozin kinazele receptorilor (RTK) sunt mediatori importanți ai proceselor celulare fiziologice, cum ar fi proliferarea, diferențierea, motilitatea sau reglarea supraviețuirii celulare. RTK include receptorul pentru factorul de creștere epidermic (EGF) și receptorul pentru insulină. Când un ligand receptor se leagă de situsul de legare specific al RTK, există o schimbare în conformație și dimerizarea ulterioară a receptorului. Aceasta duce la o transfosforilare a celor doi monomeri. Reziduurile de tirozină fosforilate ale receptorului activ formează un punct de andocare pentru proteinele adaptoare, care sunt apoi capabile să inițieze o cascadă de protein kinază. Acest principiu poate fi observat și în cazul altor receptori tirozin kinaze.
Cu ajutorul matricei fosfo-MAPK umane și a matricei fosfo-RTK umane, se poate măsura starea de fosforilare a unui număr mare de molecule de semnal, precum și fosforilarea receptorilor în procesul de transducție a semnalului. Avantajul acestor matrice este numărul mare de kinaze MAP și RTK înregistrate:
MAPK înregistrat (21 MAPK):
ERK1, ERK2, JNK1, JNK2, JNK3, JNK-pan, p38-α, p38-b, p38-g, p38d, RSK1, RSK2, GSK-3a, GSK-3b, Akt1, Akt3, Akt2, Akt pan, MSK1, MSK2, HSP27, p70 S6 kinază
RTK capturat (42 RTK):
EGFR, ErbB2, -3, -4, FGFR1, -2a, -3, -4, InsulinR, IGF1-R, Axl, Dtk, Mer, HGFR, MSPR, PDGFRa, -ß, SCFR, Flt-3, MCDFR, c-Ret, ROR1, -2, Tie-1, -2, TekA, -B, -C, VEGFR1, -2, -3, MuSK, Epha1-7, EphB1-6
Principiul măsurării
Anticorpii specifici kinazei sunt reperate ca dublete pe o membrană de nitroceluloză și sunt incubate cu lizatul celular preparat, kinazele fosforilate legându-se de anticorpii repetați. Pentru detectare, un „cocktail” de anticorpi împotriva celor 21 kinaze specifice, la capătul căruia este cuplată biotina, este pipetat pe fiecare loc. Pentru fiecare loc, se creează un strat multistrat de anticorpi imobilizați, kinază și complexul anticorp-biotină sub forma unui „sandwich molecular”. Reacția efectivă de detecție are loc apoi prin adăugarea streptavidinei-HRP și detectarea chemiluminescenței.
Evaluarea procesului
Celulele au fost tratate cu substratul timp de 15 minute sau au fost lăsate netratate. După ce lizatul celular a fost preparat și incubat cu anticorpii, acesta este detectat prin intermediul chemiluminescenței. Imaginile digitalizate sunt apoi evaluate densitometric și intensitatea pixelilor este afișată grafic.
cheltuieli
Aproximativ. 380 € pentru 4 probe pentru determinarea simultană a 21 MAPK
Aproximativ. 450 € pentru 4 probe pentru determinarea simultană a 42 RTK
Exemplu de aplicație (general)
Influența de reglementare a ingredientelor alimentare asupra fosforilării proteinelor sau receptorilor semnal în contextul răspunsului imun (Wang și colab. 2007 și Stehphen și colab. 2007) precum și influența oligozaharidelor din lapte asupra proceselor traductorului de semnal (Kuntz și colab. 2009).