Influența sedimentării zincului și lipidelor asupra izomerazei 3, 2-enoil-CoA și caracteristicilor selectate
1 Influența sedimentării zincului și lipidelor asupra izomerazei 3, 2-enoil-CoA și caracteristicilor selectate ale metabolismului lipidic al șobolanilor în creștere Jennifer Justus Disertație inaugurală pentru obținerea doctoratului (Dr. oec. Troph.) La Facultatea de Științe Agricole, Ecotrofologie și Managementul Mediului Justus- Universitatea Liebig Giessen
3 De la Institutul pentru nutriție animală și fiziologie nutrițională de la Universitatea Justus Liebig din Gießen Influența sedimentării zincului și lipidelor asupra izomerazei Δ 3, Δ 2-enoyl-CoA și caracteristici selectate ale metabolismului lipidic al șobolanilor în creștere Disertație inaugurală pentru obținerea diplomei de doctor (Dr. oec . trof.) la Facultatea 09 - Științe agricole, ecotrofologie și managementul mediului al Universității Justus Liebig Giessen prezentat de Dipl. oec. trofeu. Jennifer Justus Giessen 2007
4 Disertație la Facultatea de Științe Agricole, Științe Nutritive și Managementul Mediului la Universitatea Justus Liebig din Gießen Decan: Prof. Dr. Comitetul de examinare R. Herrmann: Președinte: Prof. Dr. I. Hoffmann 1 recenzor: Prof. Dr. E. Weigand Recenzorul 2: Prof. Dr. J. Pallauf Examinator: Prof. Dr. H. Brückner Examinator: PD Dr. Ziua Disputării S. Rudloff: 22 ianuarie 2007
5 Cuprins I Cuprins Lista figurilor. Lista IV de prezentări generale. V Lista tabelelor și figurilor anexe. VII Lista abrevierilor. IX 1 Introducere Deficitul de zinc și influența acestuia asupra metabolismului lipidic Elementul de urină Deficitul de zinc Funcțiile biologice ale zincului Metabolizarea zincului și determinarea stării zincului Reglarea expresiei genice prin zinc Modificări ale metabolismului lipidic și metabolismul specific al acizilor grași nesaturați Modificări ale metabolismului lipidic în deficit de zinc Degradarea acizilor grași nesaturați și funcția de Δ 3, Δ 2 -Enoyl- CoA izomerază Potențialul de modulare a expresiei acizilor grași nesaturați Partea experimentală Întrebare de cercetare Descrierea experimentului Compoziția dietelor experimentale Obținerea și prelucrarea materialului de analiză Metode analitice Hemoglobină, hematocrit Conținut de grăsimi din materii fecale Determinarea stării de zinc Concentrații de proteine Activitatea izomerazei Δ 3, Δ 2 -Enoyl-CoA Recuperarea fracțiilor mitocondriale Δ 3, Δ 2-enoil-CoA izomerază testare succinat dehidrogenază testare analiză expresie genică extracție ARN total. 37
6 II Cuprins Electroforeză pe gel de agaroză RT-PCR și evaluarea densităților optice Profilul lipidic Lipidele plasmatice Profilul lipidic al ficatului Model de acizi grași ai fracțiunilor lipidice ale ficatului Corpuri cetonici în plasmă și urină 2-enoil-CoA izomerază mrna-expresie a izomerazei Δ 3, Δ 2-enoyl-CoA și a fracțiunilor lipidice lipidice alfa și gamma PPAR ale ficatului Acidul gras ficat fracțiunile lipidice hepatice corpurile cetonice Discuție Comentariu asupra modelului animal Influența alimentării cu lipide alimentare și zinc Creșterea și statutul de zinc al animalelor testate Influența sedimentării zincului și lipidelor asupra activității și expresiei izomerazei Δ 3, Δ 2-enoil-CoA Influența expresiei PPARalfa, PPARgamma și concentrației corpului cetonice Efecte asupra profilului lipidic al plasmei și ficatului Influența zincului - și sedimentarea lipidelor pe modelul de acizi grași al lipidelor totale, trigliceridelor și fosfolipidelor hepatice Concluzie Rezumat Bibliografie Anexă. 106
7 Cuprins III Rezumat Rezumat Explicație. 136
10 VI Cuprins Prezentare generală 23: Prezentare generală 24: Prezentare generală 25: Prezentare generală 26: Prezentare generală 27: Conținut relativ relativ de lipide, colesterol, trigliceride și fosfolipide în ficat (mg/100 g greutate vie). 59 acizi grași din totalul lipidelor din ficat (g/100g acizi grași totali). 61 acizi grași ai lipidelor hepatice totale (mg/g ficat FM). 64 acizi grași ai fracției trigliceridelor hepatice (g/100g acizi grași total). 66 acizi grași ai fracției fosfolipidice hepatice (g/100g acizi grași totali). 67
12 VIII Cuprins Tabelul A 23: Tabelul A 24: Concentrațiile de 3-hidroxibutirat în plasmă și în urină din perioada de colectare Ester metilic FS în amestecul FAME C4-C24 (18919, Sigma) Tabelul A 25: Date LCQ Figura A 1: Structura moleculară și greutatea moleculară a trans-3-hexenoil-coa Figura A 2: Spectre de masă ale trans-3-hexenoil-coa purificate, modul pozitiv de mai sus, modul negativ de mai jos Figura A 3: Protocolul kitului auto 3-HB (Wako Chemicals). 132
13 Cuprins IX Lista abrevierilor 3-HB 3-Hidroxibutirat AI Aport adecvat ALA acid alfa-linolenic AP Fosfatază alcalină BHT Butilhidroxiltoluen BSA Ser albumină bovină Col colesterol CoA Coenzimă A CRIP proteine intestinale bogate în cisteină DCIP 2,6-diclor 1 (de asemenea Nramp2) DEPC dietilpirocarbonat DHA acid docosahexaenoic DRI Consum dietetic de referință DTNB 5,5 -Ditiobis (acid 2-nitrobenzoic) ECI Δ 3, Δ 2 -enoyl-CoA izomerază EPA acid eicosapentaenoic f factor de diluție acid gras gras FAME metil ester -3-fosfat dehidrogenază GC cromatografie gazoasă GFS acizi grași saturați (dietă cu unt de cacao) GL lipide totale Hb hemoglobină Hk hematocrit HNF-4 factor nuclear hepatic-4 hzip4 uman zrt-, proteină de tip irt 4 hztl1 transportor de tip ZnT uman 1 ICP-AES Spectrometru cu emisie atomică plasmatică cuplat inductiv IS Standard intern LM Solvent M Medie
14 X Cuprins MFE1 Enzimă multifuncțională 1 minut minut Element de răspuns metalic MRE MT Metalotioneină MTF1 Factor de transcripție care leagă MRE-1 MUFS acid gras polinesaturat n.n. nedetectabil, cantitate sub limita de detecție ns nu semnificativă p Probabilitate de eroare PC fosfatidilcolină PCR polimerază reacție în lanț PL fosfolipid PP peroxizom proliferator PPAR peroxizom proliferator activat receptor PPRE PPAR element de răspuns RDA Indemnizație dietetică recomandată RT inversă transcriptază RXR SDHrogen Deviație standard X Receptdehidă SREBP-1 Sterol Regulatory Element Binding Protein-1 T a TAE TG T m TM TMSH Temperatura de recoacere Tris-Acetat-EDTA-Buffer Trigliceridă Temperatura de topire Substanță uscată N-trimetilsulfoniu hidroxid U Activitate enzimatică (unitate, fluctuație a substratului în µmol min -1) UFS nesaturat Acizi grași (dieta cu ulei de șofrănel) UL Nivel de admisie superior tolerabil v Volum cf. compara vs. versus greutatea w Zn zinc ZnT-1 transportor de zinc-1
19 Revizuirea literaturii 5 liganzi legați: de trei aminoacizi (His, Glu, Asp sau Cys) și o moleculă de apă. Zincul este fixat de trei His în anhidrază carbonică și de His-Glu-His în carboxipeptidază (VALLEE și AULD 1990, MCCALL și colab. 2000); absența zincului duce la pierderea activității catalitice. Ca o componentă structurală, zincul este legat tetraedric de patru aminoacizi (Cys sau His) și influențează conformația locală și stabilitatea enzimei (Figura 1 A). AB Figura 1: Structurile de zinc (A) în metalloenzimele zincului, (B) în domeniile de legare a ADN ale factorilor de transcripție (conform VALLEE și AULD 1992) Zincul determină, de asemenea, structura tridimensională a proteinelor degetului de zinc, a grupului de zinc și a rotației zincului, un grup de factori de transcripție care conțin zinc ( Figura 1 B). Proteinele degetelor din zinc se numără printre cele mai frecvente proteine din genomul eucariot, care, datorită conformației lor tridimensionale, pot interacționa direct cu ADN-ul. Unele dintre diversele lor funcții în reglarea transcripțională sunt încă clarificate (LAITY și colab. 2001). Cys 2 His 2 și Cys 3 Degetele sale de zinc pot recunoaște, de asemenea, secvențe specifice de ARN prin diferite mecanisme și se pot lega de ele (HALL 2005).
24 10 Revizuirea literaturii 2.2 Reglarea expresiei genice prin zinc Atât funcția catalitică și structurală, cât și funcția de reglare a zincului sunt legate de o influență asupra expresiei genice (revizuită de VALLEE și FALCHUK 1993, COUSINS 1998, DREOSTI 2001). Ca etapă esențială în transcriere, sinteza ARN are loc prin activitatea catalitică a ARN polimerazelor, care, ca metaloenzime, necesită doi atomi de zinc. Importanța funcției structurale a zincului este dezvăluită cel mai impresionant de motivele degetelor de zinc: Structura degetului în formă de buclă este creată atunci când un atom de zinc este tetraedric complexat de resturi de cisteinil sau histidil ale lanțului peptidic (Figura 1 B). Este o condiție prealabilă pentru interacțiunea cu ADN-ul. Conform noilor calcule, 10% din proteomul uman sunt proteine potențial care leagă zincul (ANDREINI și colab. 2006), dintre care cea mai numeroasă clasă sunt degetele de zinc, majoritatea funcționând ca factori de transcripție. Gene care răspund la zinc modulare fiziologică reglare directă mediatori secundari transcripție reglementată transcripție reglementată proteine mrnas Figura 3: Niveluri posibile de influență ale zincului asupra expresiei genice (după COUSINS 1998)
58 44 Partea experimentală, Prezentare generală 14: Parametri GC și programe de temperatură pentru determinarea modelului FS Detecție: gaze combustibile FID: H 2 (35 ccm/min) aer sintetic (250 ccm/min) gaz de machiaj N 2 (25 ccm/min) Autosampler: Chrompack Type 910 Injecție: Split Volum: 1 µl Incrustare: clopot din sticlă Gaz purtător: H 2 extracte lipidice totale: Splitflow: 25 ccm/min Presiune gaz transport: 80 kpa Program de temperatură: 200 C, 2 C/min până la 220 C 220 C eluat triglicerid min: debit divizat: 20 ccm/min presiune admisie gaz purtător: 60 kpa program de temperatură: 220 C 23 min 2 C/min la 230 C 230 C 35 min eluat de fosfolipid: debit divizat: 15 ccm/min presiune admisie gaz purtător: 55 kpa Program de temperatură: 220 C 20 min 4 C/min până la 235 C 235 C 25 min
59 Partea experimentală 45 Rata de recuperare a standardului FAME a fost verificată în mod regulat (după 2 până la 3 probe) și cel puțin trei teste GC pe probă au fost utilizate pentru evaluare. Vârfurile care nu au putut fi atribuite niciunui FS nu au fost incluse în analiză. Limita de cuantificare a fost de 0,05% până la 0,2% (g/g) din totalul acizilor grași, în funcție de FA individuală și de conținutul de lipide al extractului. O cromatogramă a standardului FAME este prezentată în Figura 7. Numele complete ale FAME-urilor conținute sunt date în apendice. Figura 7: Cromatograma GC a corpurilor cetonice FAME-Mix C4-C în plasmă și urină Concentrația de 3-hidroxibutirat (3-HB) în plasmă și urină a fost determinată cu autokitul 3-HB (Wako Chemicals). Protocolul de determinare este dat în anexă. Au fost utilizate 8 µl de plasmă sau 20 µl de urină și pentru determinarea valorii necompletate aqua bidest. Standardul 3-HB (Ketone Body Calibrator 300) a fost diluat în funcție de volumul probei. Concentrațiile de 3-HB în plasmă și urină au fost determinate în duplicat la cinci animale per grup.