Micrometastaze în ganglionii limfatici santinelă în cancerul gastric - British Cancer Journal
Abstract
Principal
Materiale și metode
Probele chirurgicale și prepararea sângelui
Masă completă
Un total de 11 ganglioni limfatici reprezentativi care conțin cancer gastric metastazat și MKN-45, o linie celulară de cancer gastric, au servit drept martori pozitivi și ganglioni limfatici de la cinci pacienți supuși unei intervenții chirurgicale pentru afecțiuni necanceroase ca martori. Mai mult, 10 ml de sânge au fost colectați în tuburi conținând citrat de sodiu și centrifugați cu soluție hipotonică cu gradient de densitate, apoi celulele nucleate au fost colectate în sânge. Aceste limfocite din sânge periferic de la cinci donatori sănătoși au fost apoi utilizate ca un control negativ suplimentar.
Testul RT-PCR și Southern blot
Imunocolorarea
Toate probele au fost fixate în 10% formalină, încorporate în parafină și tăiate în secțiuni seriale de 4 μm. Probele au fost imunomarcate pentru CK-18 utilizând metoda complexului avidin-biotin-peroxidază. După deparafinare, secțiunile au fost tratate cu 0,3% peroxid de hidrogen în metanol timp de 30 de minute pentru a bloca peroxidaza endogenă și s-au spălat cu soluție salină tamponată cu fosfat. Probele au fost apoi incubate cu ser normal de capră timp de 30 de minute pentru a îndepărta colorarea nespecifică și au fost reacționate peste noapte la 4 ° C cu anticorpul monoclonal anti-CK-18 diluat 1: 100. Anti-iepure de capră și peroxidază anti-șoarece imunoglobulina marcată (reactiv polimeric marcat) (Dakopatts) a fost aplicată timp de 60 de minute ca anticorpi secundari. În cele din urmă, diaminobenzidina a fost adăugată pentru dezvoltarea culorii și verde de metil a fost utilizat pentru colorarea nucleară. IgG de iepure normal a fost utilizat în locul anticorpului primar pentru controlul negativ.
Micrometastază
În acest studiu, micrometastaza a fost definită ca metastază detectată numai prin RT-PCR și testul Southern blot sau imunocolorarea.
Rezultate
Expresia ARNm a markerului tumoral în controale
Niciunul dintre cei patru markeri mARN, CK-18, CEA, hTRT sau MUC-1, nu a fost exprimat în niciunul dintre controalele negative, și anume limfocite de la cinci donatori sănătoși și cinci ganglioni limfatici de la pacienții fără cancer. CK-18 a fost exprimat în opt (73%) din unsprezece ganglioni limfatici care conțin metastaze ale cancerului gastric, CEA în șapte (64%), hTRT în șase (55%) și MUC-1 în șase (55%). Cu alte cuvinte, cel puțin un marker mARN a fost exprimat în toți martorii pozitivi. CK-18 și CEA au reușit să detecteze o celulă MKN-45 în 10 6 limfocite, 10 celule hTRT și 100 celule MUC-1100 (Figura 1).
Sensibilități ale RT-PCR și analiza Southern blot a markerilor mARN pentru cancerul gastric. În 106 limfocite, o celulă a liniei celulare de cancer gastric MKN-45 ar putea fi detectată de CK-18 și CEA, 10 celule ar putea fi detectate de hTRT și 100 de celule ar putea fi detectate de MUC-1.