Model de apendectomie murină a cancerului colorectal asociat colitei cronice prin localizare precisă
rezumat
Protocolul prezentat descrie o îndepărtare chirurgicală simplă a apendicelui (plasture cecal) la un șoarece, urmată de inducerea cancerului de colon asociat cu boli inflamatorii intestinale. Acest model de apendectomie murină permite investigarea rolului biologic al apendicelui în patogeneza bolii gastrointestinale umane.
Abstract
Introducere
Apendicectomia clinică este o procedură chirurgicală standard cu îndepărtarea apendicelui, în principal datorită inflamației (de exemplu, apendicita) 1, 2, 3. Cu toate acestea, funcția biologică a apendicelui uman vermiform rămâne controversată 4, 5, 6. Apendicele a fost considerat a fi o rămășiță vestigială proiectată din cecum în intestinul gros. Până de curând, studiile evolutive, imunologice, morfologice și microbiologice au indicat că apendicele poate avea funcții diferite. Aceste roluri includ producerea de imunoglobine (de exemplu, IgA și IgG), o varietate de celule B și celule T, care sunt critice pentru răspunsurile imune adaptive în țesuturile limfoide asociate intestinului (GALT) și reaprovizionarea intestinului gros. cu microbiota comensală. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 .
Studiile clinice epidemiologice ale pacienților cu apendicectomie anterioară sau apendicită acută au, de asemenea, rolul lor potențial în patogeneza bolilor umane, cum ar fi boala inflamatorie a intestinului (IBD), cancerul de colon și bolile non-gastrointestinale (de exemplu Parkinson și bolile cardiovasculare) 13, 14, 15, 16, 17, 18. De exemplu, un studiu de cohorte al populației asiatice cu 75.979 de pacienți cu apendectomie a arătat recent o asociere semnificativă între cancerul apendectal și ratele de mortalitate 14, 19. În consecință, stabilirea unui model adecvat de apendectomie animală care seamănă cu un om va fi de ajutor în studierea funcțiilor biologice și a mecanismelor moleculare ale apendicelui în patogeneza bolii.
Multe mamifere au un apendice sau un organ asemănător apendicelui, inclusiv primate, lagomorfi (de exemplu iepuri), unele rozătoare și marsupiale 20. La animalele de laborator mici și utilizate frecvent, iepurele are apendicele vermiform, care este similar cu omul 21, 22, dar GALT la iepuri este extrem de mare în comparație cu oamenii, deoarece majoritatea țesuturilor limfatice se găsesc și în plasturile Peyer, ambele subțiri - precum și în colon 21. În plus, iepurele prezintă o structură foliculară limfoidă diferită, distribuția celulelor T și densitatea imunoglobulinei de la oameni, făcând anexele lor nepotrivite pentru studiul 21 .
Șoarecii sunt cel mai utilizat model animal pentru studierea fiziopatologiei umane și pentru testarea diferitelor terapeutice existente și noi 23, 24, 25. Se crede că grupul mare limfoid alb de la vârful cecului la șoareci, cunoscut sub numele de plasture cecal, îndeplinește funcții similare cu cele din apendicele uman 26, 27, 28. Cu toate acestea, este practic dificil să separi peticul de cec de cec la șoareci. Până în prezent, procedurile chirurgicale obișnuite pentru inducerea apendicitei la un model de șoarece au implicat o incizie relativ mare (de exemplu, 1-2 cm) prin peretele abdominal, pentru a avea acces la întregul cec (Tabelul suplimentar 1) 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 .
Aici, pentru a genera un model de apendectomie legat de boala gastro-intestinală, acest raport prezintă un protocol chirurgical ușor pentru îndepărtarea lucrărilor de tencuială cecală la șoareci. Aceasta este urmată de administrarea combinată a agentului genotoxic AOM și a agentului proinflamator DSS pentru inducerea cancerului de colon asociat colitei similar cu cel la oameni. IBD s-a dovedit a fi un factor de risc pentru cancerul de colon 37, 38. Combinația de cancer de colon asociat colitei cronice indusă de AOM/DSS este bine stabilită și cititorii pot face referire la Neufert și colab. și Thaker și colab. consultați 39, 40 pentru proceduri detaliate. Acest model reproductibil și rapid de apendectomie murină poate fi utilizat pentru a studia inflamația intestinală modulată în apendice și microbiota colonului, în special în dezvoltarea și progresia IBD și a cancerului de colon.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
Toate practicile la animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din Universitatea Xi'an Jiaotong (Nr. XJTULAC2019-1023).
2. Inducerea cancerului de colon asociat colitei cronice cu AOM și DSS
NOTĂ: Efectuați această procedură la 7 zile după apendicectomie.
3. Evaluarea inflamației intestinale și a tumorii (70 de zile după administrarea AOM)
- Sacrificați șoarecii prin inhalarea CO2 la o rată de umplere de 10% în camera de eutanasie, urmată de luxația colului uterin.
- Recoltați întregul colon de la vârful joncțiunii ileo-colice până la anus.
- Expuneți partea lumenului prin deschiderea colonului pe lungime. Tăiați întregul colon în bucăți lungi de 10 cm și fixați țesutul colonului în 10% formalină timp de 72 de ore pentru colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E).
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
Stabilirea unui model de apendectomie murină
Acest model de apendectomie murină a cancerului de colon asociat colitei cronice poate fi generat urmând pașii chirurgicali secvențiali și de inducție, așa cum se arată în Figura 1afișate. Cele mai frecvente poziții ale cecului sunt în fosa iliacă stângă și dreaptă, urmate de linia mediană a abdomenului (Figura 2). Rata cu succes a pre-localizării cecului înainte de incizia abdominală utilizând metoda palparii este de aproape 70% (Informații suplimentare, tabelul S2). Procedurile de apendectomie cuprind în esență șase etape importante (Figura 3). În timpul apendicectomiei, o incizie a liniei medii de până la 0,5-1,0 cm lungime este critică pentru a minimiza traumatismele chirurgicale (Figura 3A.). În cazul scurgerii intraperitoneale, sunt necesare ligarea vaselor mezangiale și închiderea butucului cecului, cu suturi care rulează în locul ligaturii simple (Figura 3B, C, D, E).
Evaluarea IgA ca biomarker la șoareci de apendectomie
Pentru a confirma micotomia apendicelui, intestinul gros al șoarecilor și conținutul de fecale au fost recoltate după operație pentru a determina concentrațiile de celule plasmatice specifice IgA și concentrațiile secretoare de IgA (sIgA). Șoarecii cu apendectomie au arătat o reducere semnificativă a procentului de celule plasmatice specifice B220-IgA + comparativ cu grupul fals (Figura 4DIN). În plus, șoarecii fals au menținut concentrația de fecal SIgA timp de 14 zile după operație, comparativ cu propria lor stare inițială înainte de operație, în timp ce grupul cu apendectomie a prezentat o reducere semnificativă a SLgA în ziua 14 (Figura 4C.).
Validarea cancerului de colon asociat colitei la șoareci din apendice
Comparativ cu 3% DSS, în care majoritatea șoarecilor din grupul cu apendectomie au prezentat complicații severe și pierderi semnificative în greutate (Figura 5A.), 2% DSS combinat cu AOM au furnizat 80% supraviețuire atât în grupurile simulate, cât și în cele cu apendectomie, modificări adecvate ale greutății corporale (Figura 5E.). La sfârșitul a trei cicluri de tratament, intestinul gros a fost recoltat pentru evaluare patologică. Inspecția vizuală și colorarea H&E au relevat tumorile colonului cu inflamație a colonului și diferite grade de adenocarcinoame (adenocarcinoame bine, moderate și slab diferențiate) la șoareci tratați cu 2% AOM/DSS (Figura 6).
(A.) O schemă a etapelor chirurgicale majore (primele trei sunt critice) în apendicectomie. (B.Inducerea cancerului de colon. La șapte zile după operația de apendice, AOM și DSS au fost administrate simultan. Greutățile șoarecilor au fost înregistrate în momente diferite (triunghi roșu). În ziua 70 după operație, șoarecii au fost sacrificați și țesutul intestinal recoltat pentru studii ulterioare. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.
(A.) Rezumatul probabilității de a găsi o poziție cecum. Imagini anatomice ale celor mai comune poziții ale cecului pe (B.) dreapta-jos, (C.) Mijlociu și (D.) burtica stanga jos a mouse-ului. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.
(A.) Incizie mică, aranjată 0,5-1,0 cm; (B.) Scoateți partea exactă a plasturelui cecal după ce ați poziționat cecul. (C.) Ligarea vaselor mezenterice care însoțesc cecul. (D.) Marcarea zonei tăiate a cecului cu sutură 4-0. (E.) Închideți butucul cu suturi rulante cu sutura 8-0. (F.) Închiderea stratului muscular cu suturi întrerupte cu sutura 8-0. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.
(A.) Puncte reprezentative pentru celulele colorate cu anti-IgA și B220 în întregul colon al șoarecilor fals și apendectomie la 1 zi și 14 zile după operație. Limfocitele din lamina propria au fost proaspăt preparate și colorate cu IgA anti-șoarece FITC, CD45R/B220 anti-șoarece PE pentru citometrie în flux. Numerele din diagrame indică procente de celule în zonele respective. (B.) Determinarea cantitativă a celulelor plasmatice specifice IgA în grupuri de fals și apendectomie. Datele reprezintă media sD; n = 5-8 șoareci; * p Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
Un model de apendectomie murină a cancerului de colon asociat colitei a fost obținut cu etape chirurgicale cu o rată ridicată de supraviețuire la șoareci. În majoritatea cazurilor a fost dificil să se anticipeze poziția sa fără o laparotomie, deoarece cecul a fost poziționat sub peretele abdominal(Tabel suplimentar 1, tabel suplimentar 2și Figura 2) deoarece era dificil să-i anticipezi poziția fără o laparotomie. În acest protocol chirurgical, a fost introdus un pas simplu pentru atingerea umflăturii, iar evaluarea cantitativă a localizării cecului a fost, de asemenea, furnizată ca un ghid pentru creșterea preciziei pentru localizarea prealabilă a cecului (Figura 2). Utilizarea caracteristicilor anatomice pentru îndepărtarea plasturelui cecal a minimizat întreruperea părților neintenționate ale intestinului, reducând astfel rata posibilelor complicații ale apendicitei și infecției cavității abdominale.
Există trei pași importanți implicați în acest model. În primul rând, examinarea vizuală și palparea înainte de laparotomie pot fi utile în determinarea localizării generale a cecului. În ciuda faptului că cecul este cel mai probabil să se afle în regiunea iliacă stângă a abdomenului, peticul cecal care iese din vârful cecului este adesea disociativ (adică în mișcare sau cuibărit) și este mai probabil să se găsească sub peritoneul mediu (Figura 2). În al doilea rând, este preferată o mică incizie pe linia mediană a abdomenului și expunerea precisă a plasturelui cecal. Acest lucru se datorează faptului că există o pată subțire pe linia mediană a abdomenului, unde tăierea în acea poziție poate reduce posibilele leziuni ale stratului muscular abdominal. Pentru a evita volvulusul în apendicită, care dăunează șoarecilor, expunerea precisă a plasturelui cecal minimizează întreruperea accidentală a intestinului și reduce riscul apariției volvulusului. În plus, expunerea minimă la cavitatea abdominală poate asigura că intestinele rămân libere, calde și umede; În caz contrar, expunerea excesivă poate duce la pierderi semnificative de căldură și uscarea țesuturilor 41 .
În al treilea rând, dezinfectarea și închiderea butucului cecal cu suturi care rulează în loc de ligaturare simplă sunt necesare pentru a preveni posibilele sângerări și dezinfectarea conținutului cecal al butucului. Nivelurile de celule plasmatice specifice IgA și fecale în intestinul gros al șoarecilor sunt semnificativ reduse prin apendectomie, sugerând că plasturele cecal este locul principal pentru producerea IgA, cel puțin în faza inițială 33. În intestinul gros, sIgA acționează ca un apărător al sănătății mucoasei prin stabilizarea colonizării normale a florei plantelor și contracararea microbilor patogeni 42. Îndepărtarea apendicelui reduce producția de IgA și poate perturba ostaza mucoasei.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.