Modelul șoarecelui tratat cu cefoperazonă al tulpinii de Clostridium difficile relevantă clinic R20291

rezumat

Acest protocol descrie modelul cefoperazonei de șoarece a infecției cu Clostridium difficile (CDI) folosind o tulpină relevantă clinic și tratabilă genetic, R20291. Accentul pus pe supravegherea clinică a bolii C., enumerarea bacteriană dificilă, citotoxicitatea toxinei și modificările histopatologice în CDI într-un model de șoarece sunt detaliate în protocol.

Introducere

Clostridium difficile este un bacil anaerob, gram-pozitiv care formează spori, care provoacă diaree care pune viața în pericol 1. Infecția cu C. difficile (CDI) este asociată cu morbiditate și mortalitate umană crescute și are ca rezultat costuri de peste 4,8 miliarde USD pe an. În 2013, Centrele pentru Controlul și Prevenirea Bolilor au clasificat C. difficile drept un risc urgent pentru rezistența la antibiotice, indicând faptul că reprezintă o amenințare urgentă pentru sănătatea publică 1. În prezent, tratamentul cu antibiotice vancomicină și metronidazol sunt considerate standard de îngrijire pentru CDI 5 Din păcate, recurența CDI după tratamentul cu succes cu antibiotice este mare, apărând la 20 - 30% dintre pacienți 2,5-7. Prin urmare, este necesară descoperirea de noi agenți terapeutici împotriva acestui agent patogen enteric. Pentru a evalua terapia împotriva C. difficile, este necesară o tulpină relevantă din punct de vedere linic un model animal care se apropie de boala AC umană.

În primul rând, postulatele lui Koch au fost stabilite pentru C. difficile în 1977 folosind un model de hamster sirian tratat cu clindamicină 8. Acest model este folosit și astăzi pentru a studia efectele toxinelor C. difficile asupra patogenezei 9.10. Cu toate acestea, CDI în modelul de hamster are ca rezultat rate de mortalitate ridicate și nu se apropie de manifestările cronice ale bolii insidioase care pot fi observate la om cu CDI 10,11. Pe baza accesibilității și disponibilității platformelor de mouse responsive în căutarea unui model de mouse de CDI este relevant.

În 2008, un model robust de șoarece de CDI a fost creat prin tratarea șoarecilor cu un cocktail de antibiotice în apă potabilă (kanamicină, gentamicină, colistină, metronidazol și vancomicină) timp de 3 zile, urmată de o injecție intraperitoneală de clindamicină 12. Acest șoarece a făcut susceptibil la CDI și colită severă. În funcție de doza de inoculum administrată, se poate observa o serie de semne clinice și letalitate folosind acest model. De atunci, au fost studiate diferite tratamente antibiotice care modifică microbiota intestinului murin, scăzând rezistența la colonizare până la punctul în care C. difficile poate coloniza tractul gastro-intestinal (revizuite în Best et al. Și Lawley & Young) 13.14.

Mai recent, o cefalosporină cu spectru larg, cefoperazonă, administrată în apă potabilă timp de 5 sau 10 zile face șoarecii susceptibili la CDI reproductibili 15. Deoarece administrarea cefalosporinelor de a treia generație este asociată cu un risc crescut de CDI la om, utilizarea cefoperazonei modelul reflectă mai îndeaproape boala naturală 16. Șoarecii tratați cu cefoperazonă susceptibili la C. difficile au fost eliberați atât cu spori de C. difficile, cât și cu celule vegetative din diferite tulpini clinice variind în relevanță și virulență 17. În ciuda unora dintre studiile originale care utilizează celule vegetative de C. difficile. considerat modul principal de transmisie 18.

În ultimul deceniu, C. difficile R20291, tulpina NAP1/BI/027, a apărut, provocând epidemii de CDI 19,20. Am căutat să determinăm evoluția clinică a bolii atunci când șoarecii tratați cu cefoperazonă au fost expuși la tulpina de C. difficile relevantă clinic și tratabilă genetic, R20291. Acest protocol detaliază evoluția clinică, incluzând pierderea în greutate, colonizarea bacteriană, citotoxicitatea toxinei și modificările histopatologice ale tractului gastro-intestinal al șoarecilor infectați cu spori C.2020 difficile R20291. În general, acest model de șoarece se dovedește a fi o platformă experimentală valoroasă pentru CDI care se apropie de boala umană. Prin urmare, acest model de șoarece caracterizat poate fi utilizat pentru a evalua efectele noilor terapii asupra ameliorării bolii clinice și asupra restabilirii rezistenței la colonizare împotriva C. difficile.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Declarație etică:
Comisia instituțională de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) de la Colegiul de Medicină Veterinară al Universității de Stat din Carolina de Nord (NCSU) a aprobat acest studiu. Politica NCSU de îngrijire și utilizare a animalelor aplică standardele și liniile directoare stabilite în Legea privind extinderea cercetării de bunăstare și sănătate a animalelor de laborator din 1985. Facilitățile pentru animale de companie de la NCSU respectă liniile directoare stabilite în Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Condiții de sănătate Animalele au fost evaluate zilnic, iar animalele moribunde au fost eutanasiate uman prin asfixierea CO2 urmată de măsuri secundare. tehnicieni instruiți pentru animale sau un medic veterinar au efectuat reproducerea într-o unitate AAALAC acreditată în timpul acestui studiu.

1. Administrarea antibioticului cefoperazonă în apa potabilă pentru a atinge sensibilitatea la C. difficile Colonizare și boală

NOTE:/6 șoareci WT cu vârsta cuprinsă între 5 și 8 săptămâni C57BL (de sex feminin și masculin) au fost cumpărați și puși în carantină timp de 1 săptămână înainte de începerea administrării de antibiotice de apă. După carantină, șoarecii au fost adăpostiți cu hrană autoclavată, așternuturi și apă. Schimbările în cușcă au fost efectuate săptămânal de către personalul laboratorului într-o hotă cu flux laminar.

  1. Pregătiți cefoperazonă (0,5 mg/ml) în apă distilată sterilă cu 7 zile înainte de ziua țintă de provocare (Figura 1).
  2. Umpleți sticlele de apă autoclavate cu apă de cefoperazonă (0,5 mg/ml) și puneți-le în fiecare cușcă de șoarece.
    NOTĂ: Apa de cefoperazonă proaspăt preparată trebuie făcută și schimbată la fiecare 2 zile pentru o perioadă de 5 zile, după cum se menționează la pașii 1.1 și 1.2. Se recomandă eliminarea adecvată a apei de cefoperazonă în conformitate cu liniile directoare instituționale de sănătate și siguranță a mediului.
  3. După 5 zile pe apă cu cefoperazonă, înlocuiți sticlele cu sticle de apă autoclavate umplute cu apă distilată sterilă. Dați șoarecelui și apei potabile pe durata experimentului.

2. Pregătirea inoculului de spori de C. difficile și gavajul șoarecilor

NOTĂ: Înainte de a începe, asigurați-vă că următoarele sunt plasate în camera anaerobă timp de cel puțin 24 de ore: 1x soluție salină tamponată cu fosfat (PBS; vezi Materiale), plăci de cicloserină taurocolat cefoxitină fructoză agar (TCCFA) (vezi Materiale și fișa suplimentară) și un retractor steril în formă de L.