O abordare de afinitate a ADN-G-quadruplex pentru purificarea enzimei active G4 Resolvază1

rezumat

G4 Resolvază1 se leagă de structurile G-quadruplex (G4) cu cea mai strânsă afinitate raportată pentru o proteină de legare G4 și reprezintă cea mai mare parte a activității de derulare a ADN-ului G4 în celulele HeLa. Vom descrie un protocol nou care profită de afinitate și de activitatea de deconectare dependentă de ATP a G4-Resolvazei1 pentru a purifica în mod specific G4R1 recombinant activ catalitic.

Abstract

Introducere

Aici demonstrăm un nou sistem de expresie și purificare (Figura 1) care profită de activitatea AT-dependentă de rezolvare a G4 a rG4R1 pentru a izola eficient enzima activă. Acest sistem ar putea fi adaptat pentru a purifica alte enzime ale acidului nucleic dependente de ATP pentru care produsul reacției enzimatice este mai mult un substrat pentru legare, așa cum este cazul G4R1.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

1. Pregătirea structurilor G4-ADN pentru a fi utilizate pentru purificarea rG4R1 (Formarea G4-ADN G-quadruplex biotinilat)

  1. Comandați următorul oligomer ADN, numit Z33-Bio, la scara de 1 µmol: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotină 3'. Asigurați-vă că fragmentul de biotină se află la capătul 3 'al oligomerului.
  2. Pregătiți un tampon 10x G4: 450 mM Tris-HCI pH 8, 25 mM EDTA și 2500 mM NaCI.
  3. Resuspendați oligomerul Z33 în 250 pl de apă (astfel încât concentrația de oligomer să fie de aproximativ 2,5 mM). Adăugați 25 pl de tampon G4 10x și amestecați. Se incubează oligomerul la 50 ° C pentru

48 h. Centrifugați scurt tubul pentru a colecta condensul (

1000 xg, 10 s). Adăuga

2. Pregătirea structurilor ADN-G4 pentru utilizare într-o activitate enzimatică testând rG4R1 (Formarea ADN-ului G4 marcat cu TAMRA)

  1. Comandați următorul oligomer ADN, numit Z33-TAM, la scara de 1 µmol: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Asigurați-vă că partea TAMRA este la sfârșitul oligomerului 5.
  2. Urmați aceeași procedură descrisă în secțiunea 1 pentru formarea G-quadruplex, cu excepția faptului că umbrirea ultravioletă (UV) nu este necesară, deoarece tetrametilrhodamina (TAMRA) etichetată cu G-quadruplex va fi ușor vizibilă cu ochiul gol. Din nou, asigurați-vă că includeți un control de estompare pe gel.
  3. După efectuarea unei citiri spectrofotometrice a ADN-ului G-quadruplex marcat cu TAMRA, ca la pasul 1, diluați G-quadruplexul format la 0,2 pmol/pl cu tampon TNE. În cele din urmă, adăugați glicerol la o concentrație finală de 10% și depozitați la -20 ° C.

3. Transformă (DE3) pLysS competente cu PTRiEx4-DHX36 (plasmidă care codifică G4R1 uman) și crește/induce culturi bacteriene mari

225 rpm. Cultivați culturile până când OD 600 este de aproximativ 0,4-0,6, ceea ce durează de obicei aproximativ 4 până la 6 ore, în funcție de densitatea celulară inițială.
NOTĂ: Acest lucru necesită monitorizarea periodică a densității prin citiri spectrofotometrice și este esențial să nu creștem culturile cu mult peste 0,5 OD. Ca martor pentru citiri spectrofotometrice, centrifugați 1 ml de bacterii și utilizați bulionul clarificat ca soluție de suprimare.

  • După obținerea OD 600 corect, așezați imediat culturile pe gheață și răciți-le rapid la 10 ° C. Monitorizați temperatura folosind un termometru curățat cu 70% EtOH. Accelerați răcirea prin rotirea rapidă a flacoanelor pe gheață, ceea ce limitează creșterea bacteriană înainte de inducerea proteinelor recombinante.
  • Adăugați IPTG la o concentrație finală mM 1 (

    4. Purificarea rG4R1 umană

    18.000 xg) într-o microcentrifugă la 4 ° C (

    200 pl de EB purificat conținând rG4R1. Puneți deoparte două 7 alicote (în tuburi PCR etichetate cu data corespunzătoare) pentru utilizare în testul activității enzimei de control al calității, care va testa dacă rG4R1 foarte activ a fost într-adevăr purificat.

  • Se păstrează rG4R1 purificat la -80 ° C până la momentul testării activității.

    • 5. Controlul calității testării activității enzimatice purificate rG4R1

    6. Combinarea preparatelor rG4R1 extrem de active, alicotarea și stocarea

    NOTĂ: Acest pas necesită 2 persoane. Numărul și cerințele enzimatice ale testelor din aval în care va fi utilizat rG4R1 purificat va determina câte preparate sunt necesare înainte de alicotare. Un preparat tipic constă în combinarea a 8 preparate foarte active (folosind astfel un total de culturi bacteriene induse de 16.500 ml), dar acest număr este arbitrar și este specific laboratorului.