Protecția vaselor de sânge împotriva aterosclerozei - Rolul miARN secretat de

Karine Tréguer 1, 2 *, Susanne Heydt 1 și Eduard Hergenreider 1

vaselor

1 Centru de Medicină Moleculară, Institutul de Regenerare Cardiovasculară, Facultatea de Medicină a Universității din Frankfurt, 60590 Frankfurt pe Main, Germania
2 Adresa actuală: UMR CNRS 5164, Universitatea Bordeaux 2, 146, rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux, Franța

Efectul fluxului în stabilirea plăcii ateromatoase. Cadrul superior: fluxul laminar induce expresia KLF2 în celulele endoteliale (EC). KLF2 este responsabil pentru menținerea fenotipului contractil și ateroprotector al celulelor musculare netede subiacente (SMC). Cadru inferior: Când fluxul este turbulent, în jurul unei bifurcații aterosclerotice sau a unei plăci, expresia KLF2 în EC scade și SMC-urile subiacente presupun un fenotip proliferativ pro-aterosclerotic. Comunicarea între comitetele de întreprindere și CML prin KLF2 este subiectul acestui studiu.

MiARN: un nou nivel de reglementare a expresiei genetice

Mediatori de alegere a acestei comunicări între CE și CML ar fi microARN-urile (miARN-urile). MiARN-urile sunt ARN-uri mici, monocatenare necodificatoare (22 nucleotide) care sunt transcrise în nucleu, scindate - în special de enzimele Drosha și Dicer - și încorporate într-un complex de tăcere ceea ce duce la inhibarea traducerii sau degradarea mARN-urilor țintă [7, 17]. Aceste molecule sunt deja cunoscute pentru rolul lor important în vascularizație, precum și în diferite patologii vasculare [8]. Obiectivul nostru a fost să stabilim dacă KLF2 ar putea regla expresia miARN în EC și să contribuie la aceste efecte vasculoprotectoare.

Forțele de forfecare reglează expresia miARN în EC prin intermediul KLF2

Am determinat mai întâi miARN reglementate de KLF2 și de forțele de forfecare din EC. Această dublă analiză a făcut posibilă identificarea de noi ținte ale KLF2 ca răspuns la flux: grup miR-143/145. Am validat aceste miARN-uri candidate invalidând KLF2 in vitro, și am arătat că, în absența KLF2, acest lucru grup nu mai este indus de forțe de forfecare. În plus, KLF2 este capabil să se lege de promotorul acestui lucru grup și induce-i expresia. Prin urmare, forțele de forfecare induc expresia KLF2 în CE și, la rândul său, induce expresia miR-143/145. Acest grup a fost cunoscut anterior pentru acțiunea ateroprotectoare asupra SMC-urilor [9].

miARN și comunicare intercelulară: între CE și LMC

Am căutat să verificăm dacă KLF2 ar putea controla SMC-urile într-un mod paracrin prin intermediul miR-143/145. Studii recente au demonstrat prezența miARN extracelulare în diferitele fluide ale corpului [10], miARN circulante care constituie adevărate trasoare biologice în diferite patologii precum cancerul [11, 18] sau bolile cardiovasculare [12]. Funcția biologică a miARN-urilor circulante nu este încă pe deplin înțeleasă, dar se pare că acestea pot juca un rol în comunicarea celulă-celulă [13].

Sângele conține numeroase ribonucleaze și se crede că miARN-urile circulante sunt protejate de degradare prin legarea proteinelor sau prin încorporarea lor în vezicule [15, 16], acest ultim mecanism fiind favorizat. (Figura 2A).

Analiza comunicării intercelulare. LA. Analiza biochimică a protecției miARN extracelulare. Proba este tratată cu proteinază K sau detergent pentru a degrada proteinele sau membranele lipidice, apoi ARN-urile sunt degradate prin tratament cu RNază. Dacă sunt degradate, aceasta indică faptul că au fost accesibile și dezvăluie tipul de protecție, proteină sau membrană. B. Sistem de co-cultură pentru a studia transferul de material între CE și SMC. PBS: soluție salină tampon fosfat.

Am analizat supernatantul CE supraexprimând KLF2 sau supus la solicitare de forfecare. Folosind tehnica descrisă în Figura 2, am putut arăta că acești miARN erau prezenți în mediul extracelular și sunt protejați într-o veziculă (Figura 2A). Diferite tipuri de vezicule au fost identificate și clasificate în funcție de dimensiunea și mecanismul lor de formare. Analizele aprofundate (în special prin microscopie electronică) ne-au permis să determinăm că veziculele care conțin miR-143/145 ar fi de tip microvesiculă și/sau exosom (MV).

Pentru a verifica dacă SMC-urile sunt într-adevăr capabile să utilizeze conținutul de vezicule emise de CE, am efectuat coculturi între celulele endoteliale care exprimă eGFP (proteină fluorescentă verde) sau transfectat cu miARN de la C. elegans (cel-miR-39) și SMC-urile subiacente (Figura 2B). Analiza de imunofluorescență a SMC a arătat prezența eGFP, iar analiza RT-qPCR a relevat prezența ARNm care codifică eGFP, demonstrând că EC au transmis vezicule de ARNm către SMC. Prin analiza RT-qPCR, am fost de asemenea capabili să detectăm prezența cel-miR-39 în VM; acestea sunt, de asemenea, transmise către SMC coculturate cu CE transfectate de cel-miR-39. MV-urile produse de EC transportă ARNm și miARN și pot fi încorporate de către SMC.

MiARN-urile conținute în VM endoteliale au un efect ateroprotector asupra SMC-urilor

Deoarece miR-143/145 este exprimat de ambele tipuri de celule, am încercat apoi să verificăm dacă contribuția acestor miARN de către CE a acționat asupra fenotipului SMC. Prin urmare, am inhibat producția endogenă de miARN în SMC prin inhibarea Drosha (CML KO). Atunci când aceste SMC care nu exprimă miARN endogene sunt crescute în prezența KLF2 care supraexprimă CE, este detectată o creștere a miR-143/145. Acest lucru indică faptul că miR-143/145 a fost transportat de la CE la SMC. Și am arătat că aceste miARN capturate de KO SMC duc la o reducere a țintelor pro-aterosclerotice, cum ar fi ELK1 (E douăzeci și șase ca factorul de transcripție I), KLF4 și SSH2 (slingshot-I protein fosfataza); miARN-urile endoteliale miR-143/145 transmise către SMC sunt, prin urmare, responsabile de efectele ateroprotectoare observate în SMC (Figura 3).