Protocol de analiză a cheltuielilor energetice Danio Rerio de mare randament (tradus în germană)
Abstract
Introducere
Șoarecele este în prezent modelul dominant pentru cercetarea obezității. Intervalul de generație scurtă și instrumentele genetice disponibile la șoarece au fost de neegalat până în prezent. Cu toate acestea, peștele zebră are și un interval scurt de generație (3-4 luni) și chiar depășește șoarecele într-o simplă manipulare genetică 1,2. Peștele zebră menține aproape 90% din genele mamiferelor, în timp ce șoarecele menține mult dincolo de numărul descendenților și potențialul de utilizare în ecrane genetice și medicamentoase 3.
Pentru a debloca potențialul modelului de zebră pentru studiile obezității, trebuie dezvoltate teste pentru a examina factorii care influențează reglarea greutății, inclusiv cheltuielile cu energia. Ca metaboliți, oxigenul este procesat prin β-oxidare și ciclul acidului tricarboxilic, consumat și NADH 2 este produs. Astfel, NADH 2 este un indicator direct al fluxului de metaboliți prin căile metabolice (oxidarea metabolitului). În poikiloterme, H + se scurge prin membrana mitocondrială internă, oxidarea NADH 2 decuplată de sinteza ATP este de 4-5 ori mai mică decât la animalele cu sânge cald 4. În consecință, la peștele zebră NADH 2 este foarte ferm atașat la producția de ATP prin fosforilare oxidativă conectat. Aici descriem un test care măsoară producția de NADH 2 în larvele de pește zebră ca un proxy pentru consumul de energie 5.
Consumul de oxigen este standardul de aur pentru măsurarea cheltuielilor de energie. Cu toate acestea, cel mai bine este să utilizați potențialul de producție ridicat al testului peștilor zebră, deoarece consumul de energie trebuie să fie accesibil pentru un debit ridicat. Sistemele de consum de oxigen, care depind de un sistem de circulație cu cameră închisă, sunt limitate în cantități de producție de numărul de camere prezente 6. Testele de producție a consumului de O2 în aer liber/CO 2 au fost aplicate și în peștele zebră 5.7. Aceste plăci în aer liber cu 96 de godeuri de la BasisD Systems sunt accesibile pentru un randament ridicat. Din păcate, schimbul de gaze cu mediul limitează sensibilitatea acestor teste. Recent am publicat aplicația unui test care monitorizează NADH 2 cu indicatorul redox alamarBlue 5. Acest test depășește limitările de debit și sensibilitate în analizele comune ale consumului de oxigen în peștele zebră.
Peștele zebră este un model din ce în ce mai important pentru studierea homeostaziei energiei întregului corp. În parte, deoarece peștele zebră este accesibil în viitor folosind ecrane genetice și ecrane pentru medicamente. În plus, manipularea genetică vizată, inclusiv suprataxa și knock-in, poate fi aplicată rapid. Am arătat anterior că acest test poate fi combinat cu administrarea medicamentului pentru baie și suplimentul genetic sau knockout, pentru a identifica compușii și genele care modifică rata metabolică 5. În plus, acest test trebuie exploatat pentru avantajele de mare randament inerente peștilor zebră.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Protocol
NOTĂ: Acest protocol respectă liniile directoare ale Biroului de cercetare responsabilă al Universității din Arizona și a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor
1. Creșterea și întreținerea embrionilor de pește zebră
2. Pregătiți soluția de testare
- Pregătiți soluția de test în conformitate cu tabelul 1. Soluția de testare a filtrului steril utilizând un filtru de 0,22 µm. Înainte de a începe testul, încălziți soluția sterilă de testare într-o baie de apă de 28,5 ○ C.
| componentă | % Din total | Volum (ul/10 ml) |
| Mediu embrionar 60x E3 | 1.667 | 166,7 |
| Dublu deionizat (DDI) H 2 0 | 96.233 | 9.623,3 |
| Albastru Alamar- | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0,1 | 10 |
Tabelul 1 Mediu de analiză
4. Evaluează schimbarea relativă a fluorescenței asociată tratamentului
- Modificarea fluorescenței din fiecare calcul, scăzând fluorescența la momentul 0 din fluorescența de la sfârșitul studiului. Puțurile fără pește (spații libere) ar trebui să aibă valori apropiate de 0, mult sub valorile puțurilor care conțin pești.
Modificarea fluorescenței = fluorescență la sfârșit - fluorescență la momentul 0 - Pentru a determina modificarea relativă a fluorescenței, calculați modificarea medie a fluorescenței pentru godeurile de control, apoi împărțiți schimbarea fluorescenței fiecare la variația medie a fluorescenței pentru godeurile de control. De remarcat, controalele ar putea fi fie controlul vehiculului, fie controlul genetic.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.
Rezultate reprezentative
Soluția de testare non-fluorescență în absența peștilor embrionari (1) a creste. Cu toate acestea, testul este foarte sensibil la mici modificări ale ratei metabolice în foraj. Un singur pește dintr-o fântână creează un semnal clar din fântânile goale în decurs de 1 oră (Abonament P necesar. Vă recomandăm JoVE bibliotecarului dvs.
Discuţie
Contaminarea bacteriană sau fungică va limita foarte mult aplicarea acestui test. Albastrul de metilen în mediul embrionar E3 limitează posibilitatea contaminării fungice. De-a lungul creșterii embrionilor este important să se acorde atenție îndepărtării embrionilor morți de două ori pe zi. În plus, este important să se analizeze temeinic embrionii cu mediu embrionar E3 steril în ziua zonei de inițiere a testului. Acești 2 pași limitează potențialul de contaminare bacteriană a embrionilor. Includerea godeurilor goale descrise în pasul 3.2 permite detectarea oricărei contaminări bacteriene. Contaminarea bacteriană care dă un semnal măsurabil este rară. Cu toate acestea, dacă sondele goale arată un semnal fiabil, testul trebuie repetat, trebuie să se acorde atenție menținerii curățeniei embrionilor. Dacă utilizatorul se așteaptă să existe contaminare înainte de inseminare, embrionii pot fi decolorați așa cum s-a descris mai sus (p. 22) 10. Alternativ, dacă experimentatorul suspectează că se produce contaminare după colectare, utilizatorul poate E2 înapoi cu penicilină și streptomicină pentru a utiliza embrionii până la 4 dpf (p. 23) 10.
Deși acest test este valoros pentru utilizarea în embrioni, nu am examinat validitatea acestuia la peștele zebră adult. Bănuim că toate funcțiile din acest test ar fi limitate la peștii adulți prin pătrunderea slabă a țesutului AlamarBlue. În plus, în hrănirea peștilor flora intestinală poate genera un semnal profund care nu are nicio importanță pentru metabolismul peștilor. Astfel, acest test trebuie să beneficieze de utilizarea în gălbenuș de ou care hrănește pești embrionari. Inactivitatea relativă a peștilor embrionari oferă un avantaj unic, deoarece aceasta limitează variabilitatea care ar fi asociată cu cheltuielile de energie induse de activitate 11. Deci, acest test este un instrument unic pentru a studia rata metabolică ca răspuns la manipularea genetică sau farmacologică într-un întreg sistem animal.
Peștele zebră devine rapid un model de frunte pentru tulburările metabolice care însoțesc obezitatea. De fapt, există modele ale obezității transgenice și legate de dietă, publicate 12,13. Similar cu modelele de șoarece, obezitatea indusă de dietă în peștele zebră a crescut trigliceridele serice și acumularea de lipide hepatice 12. În plus, hrana pentru pești zebră a crescut glucoza la jeun, sugerând intoleranță la glucoză 14. Folosind cea descrisă aici, am arătat că pretratarea 24 de ore cu metformină, o Sensibilizant pentru insulină, crește rata metabolică ca răspuns la testul cu insulină 5 test. Astfel, peștele zebră se poate dovedi un model ideal de animal întreg pentru a descoperi medicamente care îmbunătățesc sensibilitatea la insulină (embrion) și pentru a-și stabili eficacitatea în ameliorarea obezității de rezistența la insulină (adulți).
Dezvoltarea unor modele genetice și induse de dietă obeză, care imită fenotipurile observate la mamiferele obeze, creează impulsul inițierii morților de zebră axate pe boli metabolice. Sunt disponibile teste de mare randament pentru a aprecia pe deplin valoarea modelului de pește zebră pentru studierea homeostaziei energetice. Instrumente inovatoare pentru a permite evaluarea propulsiei fagice pentru ecrane axate pe aportul de energie, în timp ce testele de stocare a lipidelor cu randament ridicat vor duce la studii asupra homeostaziei lipidice a întregului corp 15-17. Testul pe care îl descriem aici este un instrument cu randament ridicat pentru a evalua implicarea genelor, a compușilor sau a interacțiunilor acestora asupra cheltuielilor de energie ale întregului corp.
Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.