Protocolul de formare a intervalului TreadWheel pentru exerciții fizice induse ușor la Drosophila melanogaster

rezumat

TreadWheel folosește mișcarea de rotație pentru a induce ușor exerciții la Drosophila melanogaster adult, profitând de zborul geotaxiei înnăscute și negative. Permite analiza interacțiunilor dintre exerciții fizice și factori precum genotipul, genul și dieta și efectele acestora asupra testelor fiziologice și moleculare pentru a evalua sănătatea metabolică.

Abstract

Introducere

Epidemiile de obezitate la copii și adulți cresc în culturi care consumă diete calorice ridicate și rămân inactive pentru perioade lungi de timp, ceea ce poate duce la efecte grave pe termen lung, inclusiv rezistența la insulină, inflamația cronică și osteoartrita 1, 2, 3, 4. Prevalența acestor tulburări continuă să crească din cauza dezechilibrului crescând al aportului și al cheltuielilor calorice atribuite consumului crescut de grăsimi și zaharuri și stilului de viață predominant sedentar 5. În consecință, acest dezechilibru energetic a condus la o creștere a incidenței diabetului zaharat de tip 2 (T2DM) și a bolilor cardiovasculare (BCV) 5. Persoanele prezintă un risc mai mare de a dezvolta ambele tulburări dacă au fost diagnosticate cu simptome ale sindromului metabolic (MetS), obezității abdominale și dislipidemiei 2. MetS este modelat de interacțiunile complexe dintre genotip și diferiți factori de mediu, cum ar fi dieta și exercițiile fizice 6. Deci, pentru a obține o înțelegere deplină a mecanismelor care stau la baza acestei boli complexe, luați în considerare toți acești factori.

Când vine vorba de lupta împotriva MetS, medicii recomandă mai întâi să suferiți modificări ale stilului de viață care includ o alimentație sănătoasă și echilibrată și activitate fizică 2, 7, 8. Deoarece medicamentele eficiente sunt limitate, iar operația de by-pass gastric este costisitoare și necesită supraveghere medicală pe tot parcursul vieții, intervențiile farmacologice și chirurgicale sunt recomandate numai în cazurile severe și numai împreună cu aceste modificări ale stilului de viață 3, 7, 8. În timpul intervențiilor stilului de viață, cum ar fi B. Exercițiile fizice și dieta care pot produce și menține obiective de pierdere în greutate pe termen lung, indiferent dacă aceste acțiuni corective pot atenua sau nu efectele negative asociate cu MetS necesită un studiu suplimentar 7, 8 .

Modelele de șoarece au fost folosite pentru a studia efectele exercițiilor fizice asupra tulburărilor metabolice de ani de zile; cu toate acestea, introducerea cercetării exercițiilor fizice pentru a zbura pe MetS este un demers relativ nou 9, 10, 11, 12. Muștele oferă vehiculul perfect pentru a studia exercițiul într-un cadru de laborator controlat, deoarece sunt ușor de manipulat, au o durată de viață scurtă, sunt ieftine de întreținut și căile metabolice energetice sunt extrem de conservate între Drosophila și oameni 13. D. Genomii Melanogaster sunt bine caracterizați și există o abundență de instrumente genetice pentru utilizare în Drosophila care oferă o perspectivă asupra diferitelor genotipuri și interacțiuni genotip-mediu care ar putea modula efectul exercițiului asupra sănătății organismului 14 .

Pentru a induce ușor exerciții în Drosophila, am dezvoltat o mașină de exerciții numită TreadWheel (Figura 1). TreadWheel este (denumită în continuare abreviată ca TW) mișcarea rotativă declanșează tendința de geotaxie înnăscută negativă a muștei prin gravitație pe partea superioară a flaconului, care, la rândul său, stimulează urcarea în muște pentru a o redefini constant. Spre deosebire de alte metode, mișcarea de răsucire a TW este inerent blândă, ceea ce minimizează numărul de factori de stres suplimentari care pot apărea și care pot afecta rezultatele. Astfel, exercițiul inducător de mașini la un număr mare de muște fără stres permite studierea efectelor exercițiului asupra sănătății metabolice (Figura 2), Îmbătrânirea, somnul și multe alte subiecte 11 vor permite.

Metoda noastră urmează un protocol piramidal invers, de antrenament pe intervale, care include în principal aspecte ale antrenamentului pe intervale aerobice (AIT) cu o anumită pregătire fizică de rezistență. Regimul AIT standard este modificat în acest protocol, crescând durata fiecărui interval pe o perioadă de cinci zile pentru a încuraja rezistența. AIT este deosebit de util în prevenirea MetS comparativ cu alte modalități de intervenție și a fost mai eficient în inversarea factorilor de risc frecvenți ai sindromului metabolic decât exercițiul moderat continuu 19, 20. Un dezavantaj al TW în raport cu Turnul de putere este însă că muștele se obișnuiesc mai repede cu mișcarea de rotire, astfel încât variația tendinței înnăscute de a se obișnui să ia muștele poate face dificilă interpretarea beneficiilor exercițiului. 11 O soluție elegantă la această limitare este descrisă de Watanabe și Riddle 15 și articolul lor suplimentar 21.

Protocol

1. Configurarea și funcționarea TreadWheel

Notă: vezi figura suplimentară 1 pentru schemele de circuit de pe TW Maschinenbau. Piesele necesare se află în Tabel de materialeenumerate. Frazele „TW”, „TreadWheel”, „dispozitiv de antrenament” și „mașină” sunt utilizate în mod interschimbabil pe tot protocolul.

1. Calibrați, motorul cu comutatorul de pornire/oprire, astfel încât un timp de rotație complet să fie de 15 s (4 rpm). Viteza mașinii în fața flacoanelor fixate în cleme fixate pentru a calibra brațele rotative.
   1. Reglați viteza cu un cronometru standard și un obiect imobil atașat temporar la mașină, ca o perie mică cu bandă atașată la capacul motorului, cu peria atingând un suport rotativ. Durează numărul de rotații într-un minut cu obiectul imobil ca punct de referință și reglează viteza pentru a obține o perioadă de rotație de 15 s (4 rpm).

2. Captarea și întreținerea zborului

Notă: Toate muștele sunt îngrijite într-un incubator de 25 ° C cu 50% umiditate și un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore între manipulările de pe bancă descrise. Muștele sunt hrănite cu o dietă standard de cheag de melasă de porumb, cu excepția cazului în care se specifică altfel.

1. Pregătiți fiecare genotip cu plăci de agar cu suc de mere pentru camerele de așezare, o picătură de pastă de drojdie pe placă și sticle de plastic de 6 uncii pentru a colecta ouăle care eclozează larvele.
   1. Pregătiți farfurii de agar cu suc de mere, umpleți vase Petri de 35 x 10 mm ¾ pline, dizolvate cu 3% agar în suc de mere cumpărat. Păstrați plăcile solidificate în frigider până la utilizare.
   2. Într-un tub de centrifugă conic de 50 ml, combinați drojdia uscată cumpărată cu apă distilată în raport de 2 ml de apă pentru fiecare gram de drojdie. Amestecați drojdia cu apă pentru a crea o pastă cu consistența ketchupului cu o tijă de sticlă. Reglați proporțiile de drojdie și apă după cum este necesar pentru a obține consistența dorită.
   3. Păstrați pasta de drojdie în frigider între utilizări. Slăbiți tubul capacului pentru a permite degazarea.
   4. Folosiți un ac sau un cuțit ascuțit pentru a face găuri mici în sticlele de 6 uncii cu fund pătrat (polipropilenă) ca guri de aerisire pentru camerele de așezare.
   5. Aplicați o mică pată de pastă de drojdie (

   După o zi de odihnă după finalizarea protocolului de exerciții, testați un test de performanță generală a urcării cu un test de urcare rapidă de geotaxie negativă iterativă (RING) asemănător 22 .
   Plasați grupuri de 10 muște în flacoane goale cu anestezie cu CO2 (sau atingeți direct din flacoane cu alimente dacă sunt deja sortate) și sigilați cu folie de parafină pentru a preveni scăparea muștelor. Acordați muștelor cel puțin 10 minute pentru a vă obișnui cu noile fiole. Pentru ca sticla să nu se răstoarne, bandă

   Notă: Probele, standardele, soluția standard de glicerină și soluția de lucru cu triglicerol utilizate în timpul testului trebuie păstrate pe gheață pe durata protocolului și trebuie păstrate la frigider atunci când nu sunt utilizate.

   Rezultate reprezentative

   Ne interesează în mod special identificarea factorilor care contribuie la sănătatea metabolică generală a individului. Anterior, sa constatat că interacțiunea genotipului prin dietă contribuie semnificativ la creșterea populației în proprietățile metabolice 14. Aceasta înseamnă că fiecare genotip reacționează la diferențele ecologice într-un mod unic și complex. Pentru a extinde munca noastră asupra efectelor genotip-mediu pentru a include exercițiul fizic, am dezvoltat TreadWheel, care este capabil să detecteze numeroase genotipuri pentru antrenamentul la intervale aerobe (AIT) într-un mod cu randament ridicat.

   
   
   ilustrația 1 : Bicicleta de antrenament TreadWheel. (A.) Mașina conține 48 de flacoane și are o funcție de viteză reglabilă. Aici experimentele au fost efectuate la 4 rpm. (B.) Fiole individuale cu alimente cu muștele experimentale au fost strânse, un arbore rotativ prins în poziție. (C.) Distanța dintre dopurile flaconului și alimentele a fost de 6 cm pentru flacoanele de exercițiu și 1 cm pentru flacoanele de control. Fiolele au fost apoi plasate pe computer pentru exerciții. (D.) Regimul de exerciții cu piramidă inversă de 5 zile a fost folosit pentru antrenamentul zborului. În fiecare zi s-au adăugat încă cinci minute la unul dintre atacurile de exerciții pentru a crește treptat intensitatea antrenamentului, modelele de rezistență, antrenamentele la intervale. Această cifră a fost preluată de la Mendez și colab. modificat 11. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.
   
   
   Figura 2 : Metode optice și rezultate reprezentative. (A.) Metode de testare a dieta larvelor și a interacțiunilor exercițiilor adulte. Larvele au fost crescute cu diete bogate în grăsimi sau de laborator normale și au fost trecute la aparate de locomotive în regim alimentar normal. Muștele adulte au fost separate după sex, plasate în grupuri experimentale și exercitate timp de cinci zile consecutive. Ulterior s-a efectuat un test de urcare cu geotaxie negativă de tip inel și muștele au fost înghețate pentru măsurători ale trigliceridelor. Datele reprezentative ale trigliceridelor apar două linii genetice, Oregon R și y 1 w 1 pentru (B.) Femele și bărbați (C.). Toate muștele au fost crescute după o dietă normală și exercitate la vârsta adultă. Nivelurile cu litere diferite diferă semnificativ (p 11. Date reprezentative de urcare pentru linia DGRP 153 pentru (D.) Femele și bărbați (E.) este afisat. Fiecare punct corespunde performanței medii de alpinism de 232 sau mai multe persoane în trei puncte independente în timp. Barele de eroare indică o eroare standard. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.
   
   Figura suplimentară 1: O reprezentare schematică detaliată a roții de rulare. (A.) Schema flacoanelor cu structură cu clemă dublă atașate la mașină. (B.) Vedere interioară a acționării rotative a mașinii. (C.) Proiecție paralelă a părții frontale a mașinii. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

   Discuţie

   Protocolul de exerciții detaliat aici a demonstrat că stimulează cu succes mișcarea ușoară în Drosophila și poate fi utilizat pentru a simula antrenamentul de anduranță într-un laborator controlat 11. Trebuie remarcat faptul că, la dezvoltarea inițială a conceptului TreadWheel, am luat în considerare produsele comerciale care ar putea fi modificate pentru a funcționa într-un mod similar (de exemplu, un rotisor de laborator). Cu toate acestea, am respins în cele din urmă această abordare pentru a alege un design personalizat, deoarece dispozitivele comerciale nu aveau o viteză suficient de mică (4 rpm) și nu aveau capacitatea suficientă a flaconului pentru generarea de probe cu un randament ridicat.

   Studiile efectuate cu TreadWheel au arătat că exercițiul mediu a scăzut greutatea corporală, stocarea totală a trigliceridelor și glicogenul, în timp ce crește nivelul proteinelor și crește performanța 11. În plus, au existat răspunsuri variabile despre sex și genotipuri pentru greutatea corporală, precum și trigliceride, proteine, glicogen, glucoză și niveluri de efort 11, 15. În timp ce variabilitatea răspunsului la exerciții fizice și dietă între genotipuri și sex poate fi dificil de interpretat și, uneori, contraintuitiv, reflectă sursele de variație biologică adevărată observate în populațiile naturale. Străduindu-ne să înțelegem varietatea de factori care stau la baza ratei ridicate a MetS, vom dezvolta instrumente care vor facilita dezlegarea importanței relative a diferiților factori de influență prin testarea acestui factor în organismele model pentru a dezvolta intervenții personalizate de prevenire și tratament. Pentru a evalua pe deplin eficacitatea exercițiului, fiecare dintre acești factori și modul în care interacționează trebuie luați în considerare atunci când se efectuează experimente și se trag concluzii.

   Dezvăluiri

   Autorii nu au dezvăluit nimic.

   Mulțumiri

   Dorim să mulțumim Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish și restului laboratorului Reed pentru ajutorul acordat în domeniul creșterii animalelor zburătoare și al procesării imaginilor. Sean Mendez a construit TreadWheel original cu ajutorul atelierului UAB. Acest studiu a fost finanțat de NIH R01 GM 098856 LKR Undergraduate Creativity and Research Academy la Universitatea din Alabama KEL și BJW.

   ---