Relațiile dintre grupurile de nucleotide deteriorate oxidativ și nucleosomii activi sau deschiși
subiecte
abstract
Distribuția daunelor oxidative pe baze precum 8-hidroxiguanină (8-OH-Gua) a fost determinată la nivelul rezoluției nucleotidelor utilizând tehnica PCR mediată prin ligare. Se știe că administrarea unui carcinogen renal, nitrilotriacetat de fier (III) (Fe-NTA), induce stres oxidativ și formarea ulterioară de 8-OH-Gua în rinichi. ADN-ul genomic total a fost izolat din rinichi de șobolan cu sau fără tratament cu Fe-NTA și apoi digerat cu formamidopirimidină ADN glicozilază (Fpg). Ca țintă, ne-am concentrat asupra genei unei enzime de reparare a ADN pentru timin glicol, Nth 1. Semnalele clivate au fost găsite în exonul 1 și exonul 3, dar nu în exonul 5. Nucleozomii îmbogățiți în nucleotide deteriorate în aceste regiuni au fost extrem de accesibile pentru nucleaza micrococică, în special în rinichi. Luând în considerare funcția segmentului proteic codificat de aceste regiuni, am discutat despre mecanismul molecular al formării restrânse a nucleotidelor deteriorate.
introducere
Speciile reactive de oxigen (ROS) induc diferite tipuri de deteriorare a ADN-ului, de exemplu pauzele monocatenare, pauzele dublu-catene, modificările bazelor incluzând siturile apurinei și ale pirimidei și reticularea ADN-proteine (Dizdaroglu, 1991, 1992; Halliwell și Aruoma, 1991)). S-a sugerat că deteriorarea oxidativă a genomului celular joacă un rol în cancer și îmbătrânire (Akman și colab., 1991; Basu și colab., 1989; Feig și colab., 1994; Loeb și colab., 1988; Maccabee și colab., 1994; McBride și colab., 1991; Moriya și colab., 1991; Tkeshelashvili și colab., 1991; Weitzman și Gordon, 1990; Wood și colab., 1990). 8-Hidroxiguanina (8-OH-Gua) este o formă majoră de deteriorare oxidativă a ADN-ului (Kasai și Nishimura, 1993; Umemura și colab., 1990) care induce în principal transversele GC → TA în Escherichia coli și celulele mamiferelor (Cheng și colab. 1992). Variațiile cantității de 8-OH-Gua în ADN celular pot fi măsurate prin HPLC-ECD (Floyd și colab., 1986; Kasai, 1997). Cu toate acestea, relația dintre deteriorarea ADN-ului indus și spectrele de mutație nu a fost clarificată, deoarece nu a fost încă stabilită o metodă adecvată pentru detectarea nucleotidelor deteriorate în ADN in vivo.
Recent, PCR mediată de ligatură (LM-PCR) a făcut o descoperire în detectarea nucleotidelor deteriorate la nivelul rezoluției nucleotidelor (Denissenko și colab., 1996). LM-PCR a fost dezvoltat inițial pentru secvențierea genomică, inclusiv detectarea siturilor de metilare CpG și, de asemenea, pentru amprenta in vivo (Konishi și colab., 1995; Mueller și Wold, 1989, 1991; Nomoto și colab., 1995; Pfeifer și colab. 1989). De atunci a fost aplicat analizei siturilor de scindare a nucleozei, de exemplu nuclează micrococică sau digestie DNază I, pentru cercetarea cromatinei (Kato și colab., 2000).
Segmentul proteic codificat de exonii 1 și 2 este unic pentru mamiferul Nth 1 și conține semnale de direcționare nucleare și mitocondoriale și site-uri de interacțiune presupuse pentru alte componente de reparații. Segmentul proteic responsabil pentru activitățile enzimatice bifuncționale, activitatea ADN glicozilazei și activitatea AP liasă este codificată de exonii 3 până la 6. Pentru a determina mecanismul molecular al formării restrânse a nucleotidelor deteriorate în exonii 1-4, am analizat structura cromatinei ficatului, rinichilor și splinei la șobolanii martor. Nucleozomii din exonii 1 până la 4 ai genei Nth 1 au fost ușor accesibile MNazei, în special în rinichi. Această observație ar putea oferi o indicație a susceptibilității la carcinogeneza renală.
Rezultate
Formarea restricționată regional de nucleotide deteriorate în gena Nth 1
Distribuția nucleotidelor deteriorate în gena Nth 1. ( A ) Distribuția siturilor scindate cu piperidină sau digerate Fpg pe ADN genomic din rinichi la momentele specificate după tratamentul cu Fe-NTA sau rinichiul de control fără tratament a fost analizată prin LM-PCR. ADN-ul genomic din rinichii animalelor de control a fost, de asemenea, reacționat cu DMS, apoi digerat cu piperidină și utilizat ca scară de guanină (G). Sunt prezentate profilurile de clivaj ale catenei netranscrise în exonul 1 al genei Nth 1. „Txn” indică poziția unui site preliminar de transcriere preliminară. ( ) Distribuția siturilor digerate de Fpg pe ADN genomic așa cum este descris mai sus. Sunt prezentate profilurile de clivaj ale catenei netranscrise în exonul 3 al genei Nth 1. ( c ) Este prezentată distribuția siturilor digerate Fpg pe catena netranscrisă din exonul 5 al genei Nth 1
Rezumatul nucleotidelor deteriorate din gena Nth 1. Se compară secvențele de șoarece (M) și șobolan (R). Aminoacizii derivați pot fi văzuți deasupra (șoarecele) și dedesubt (șobolan). Divergențele nucleotidice între secvențele genei Nth-1 de șoarece și șobolan sunt indicate prin litere negre inversate (pătrate umplute). Substituțiile de aminoacizi deduse sunt, de asemenea, indicate prin litere negre inversate (pătrate umplute). Nucleotidele deteriorate din gena Nth-1 de șobolan sunt prezentate în roșu; Literele roșii inversate (pătrate umplute) indică nucleotidele deteriorate care au fost detectate pe firul netranscris, în timp ce literele roșii pătrate indică acelea care au fost detectate pe firul transcris. Subliniul din exonul 1 indică un semnal țintă mitocondrial preliminar, în timp ce cel din exonul 2 indică un semnal presupus de localizare nucleară. Pătratul Lys din exonul 4 denotă un sit activ pentru activitatea ADN glicozilazei, în timp ce pătratul Asp din exonul 5 denotă un sit activ pentru activitatea AP liasă
Organizarea structurilor cromatinei din gena Nth 1
Colorarea cu bromură de etidiu a fragmentelor digerate cu nuclează micrococică (MNază). Cromatinele produse din ficat, rinichi și splină au fost digerate cu MNază după cum s-a indicat (U/ml), iar după extracția ADN-ului așa cum este descris în Materiale și metode, fragmentele de ADN digerate au fost electroforizate pe gel de agaroză 1,5%
Analiza situsurilor de clivaj cu nucleaza micrococică (MNază) din gena Nth 1. Fragmentele de ADN micrococice digerate cu nuclează preparate din ficat, rinichi și splină așa cum este descris în Fig. 3 au fost analizate prin LM-PCR. Banda etichetată „Scară G” reprezintă scara cu guanină așa cum este descris în Figura 1. Poziția estimată a fazei nucleozomului este afișată în partea dreaptă a panoului. ( A ) Distribuția situsurilor scindate de nuclează micrococică în exonul 1 al genei Nth 1. „Txn” indică poziția unui site preliminar de transcriere preliminară. ( ) Distribuția celor din exonul 3 al genei Nth 1. ( c ) Distribuția celor din exonul 5 al genei Nth 1
discuţie
Segmentul proteic codificat de exonii 1 și 2 este unic pentru mamiferul Nth 1 și se crede că conține semnale țintă nucleare și mitocondriale și site-uri de interacțiune pentru alte componente ale sistemului de reparații (Ikeda și colab., 1998). Recent, Klungland și colab. (1999) au arătat că proteina XPG activează Nth 1 la om și S. pombe și stimulează legarea proteinei Nth 1 la leziunile care conțin ADN prin interacțiune indirectă între Nth 1 și XPG. Nu s-a observat activare sau stimulare prin XPG pentru E. coli Nth 1. Prin urmare, mutațiile din aceste regiuni pot duce la localizarea intracelulară anormală a proteinei Nth 1 mutante sau la o tulburare.
materiale si metode
Animale
Șobolani masculi Wistar de șase săptămâni au fost cumpărați de la Seiwa Experimental Animal (Fukuoka, Japonia). Acestea au fost furnizate cu șobolan disponibil comercial (Clea, Tokyo, Japonia) și apă de la robinet ad libitum și utilizate după 4 zile de aclimatizare.
Produse chimice și Fpg
Fe (NO 3) 3, Na2 NTA și kitul WB Extractor WB au fost achiziționate de la Wako Biochemicals (Osaka, Japonia). Piperidina și dimetil sulfatul (DMS) provin de la Nacalai Tesque (Kyoto, Japonia). Soluția de nitriloacetat feric (Fe-NTA) a fost imediat înainte de utilizare conform metodelor lui Awai și colab. (1979) cu modificări minore. Pe scurt, Fe (NO3) 3 și Na2 NTA s-au dizolvat fiecare în apă Milli-Q și apoi s-au amestecat într-un raport molar de 1: 4. PH-ul a fost ajustat la 7,4 cu NaHC03. Fpg a fost obținut de la Trevigen (catalog nr. 4040-100-01). ADN-ul genomic a fost digerat cu Fpg conform instrucțiunilor producătorului.
Tratamentul Fe-NTA
Un total de 30 de animale au fost împărțite în Fe-NTA și grupuri de control. În grupul Fe-NTA, au fost uciși la 1, 6, 24, 72 și 120 de ore după injectarea Fe-NTA (15 mg Fe/kg greutate corporală ip). În grupul de control, au fost uciși fără tratament. Fiecare subgrup conținea cinci animale. Animalele au fost sacrificate sub anestezie cu eter. Rinichii au fost îndepărtați imediat și apoi folosiți pentru experimente. O parte a organului a fost înghețată și menținută la -80 ° C.
PCR mediată prin ligare (LM-PCR)
ADN-ul a fost extras din rinichii șobolanilor (100-200 mg) cu kitul de extragere ADN WB conform metodei Nakae și colab. (1995). ADN-ul extras a fost digerat cu Fpg așa cum s-a descris mai sus sau digerat cu piperidină 1 M timp de 30 de minute la 90 ° C (Maxam și Gilbert, 1977). Enzima Fpg recunoaște formamida pirimidinelor derivate din adenină, guanină sau 8-OH-Gua, precum și unele produse pirimidinice oxidate, cum ar fi 5-hidroxicitozina și 5-hidroxiuracilul (Tchou și colab., 1994). Pe de altă parte, reactivul chimic piperidină poate cliva multe tipuri de derivați nucleotidici, inclusiv 8-OH-Gua și compuși înrudiți (Chung și colab., 1992), precum și diferite tipuri de derivați preparați prin reacții chimice de Maxam și Gilbert. Ca o scară de control cu guanină, o alicotă de ADN genomic de la animalele de control a fost reacționată cu DMS și clivată cu piperidină așa cum s-a descris mai sus. LM-PCR a fost efectuat așa cum s-a descris anterior (Konishi și colab., 1995; Nomoto și colab., 1995). Pozițiile nucleotidice ale semnalelor de clivaj derivate din produsele LM-PCR au fost determinate din scara de control guanină și informațiile de secvență ale genei Nth-1 de șobolan.
Informațiile secvenței pentru ADNc Nth-1 de șobolan acoperă doar un fragment de 3'-329 bp (GenBank H33255). Secvența genică Nth-1 a șobolanului necesară pentru proiectarea primerilor pentru LM-PCR a fost obținută din produsele PCR genomice de șobolan amplificate cu primeri pe bază de întinderi de nucleotide între ADNc Nth-1 au fost conservate la șoareci și oameni (Aspinwall și colab., 1997; Hilbert și colab. 1997). Secvențele nucleotidice ale primerilor individuali LM-PCR au fost după cum urmează. Pentru exonul 1 al genei Nth 1: primer 1, 5'-gcctggagctaaagttccacg-3 '; Grund 2, 5'-cccctgcaggcgcagcg-3 '; Primer 3, 5'-ccctgcaggcgcagcgctacCTGC (literele mari indică secvența exonului). Pentru exonul 3: primer 1, 5'-gtagtcagagatgcctgcctc-3 '; Primer 2, 5'-ctccagaacagtgccccctcttgg-3 '; Primer 3, 5'-ccagaacagtgccccctcttggttctgttgcc-3 '. Pentru exonul 5: primer 1, 5'-cagcaggatacctctccc-3 '; Primer 2, 5'-CaccaagctacactacCTGGGTAGCC-3 '; Grund 3, 5'-ccaagctacactacCTGGGTAGCCACTCTTCCAGG-3 '. Amorsele 1 și 2 au fost utilizate pentru sinteza primelor șiruri și respectiv pentru amplificarea PCR. Grundele 3 au fost etichetate la capătul 5 'cu γ-32 P-ATP și utilizate pentru detectarea finală a scării.
Digestia cu nucleaze micrococice
Fracțiile de cromatină din ficat, rinichi și splină de la șobolani martori au fost preparate așa cum s-a descris (Gorsky și colab., 1986; Goldhamer și colab., 1995). O suspensie de cromatină în tampon de digestie, 15 mM Tris-HCI (pH 7,5), 15 mM NaCI, 60 mM KCl, 1,5 mM DTT, 0,15 mM spermidină, 0,34 mM zaharoză, 0,1 mM PMSF și 1 MM M CaCl2 a fost digerat cu diluții seriale de nuclează micrococică (Worthington Biochemical Corp.) la 20 ° C timp de 5 minute. După extracția ADN descrisă mai sus, capetele 5 ale siturilor clivate cu MNază au fost fosforilate cu polinucleotid kinază T4 și ATP rece (McPherson și colab., 1993; Truss și colab., 1995). Electroforeza ADN-ului extras a fost efectuată pe un gel de agaroză 1,5%. Probele de ADN au fost supuse LM-PCR așa cum s-a descris mai sus.
mulțumire
Această lucrare a fost susținută de subvenții de cercetare în domeniul cancerului de la Ministerul Japonez al Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei și de la Societatea Fukuoka Cancer, Fukuoka, Japonia.