Rolul fosfolipidelor și lipidelor oxidate în procesarea precursorului amiloid

Din domeniul neurologiei experimentale, medicinei teoretice și al biosciințelor Facultății de Medicină a Universității din Saarland Homburg/Saar Importanța fosfolipidelor și a lipidelor oxidate pentru prelucrarea proteinei precursoare amiloide (APP) și a bolii Alzheimer Disertație pentru obținerea gradului de doctorat Științe naturale ale Facultății de Medicină a UNIVERSITĂȚII SAARLAND 2016 prezentat de Viola J. Haupenthal născut la 24 august 1982 la Saarbrücken

fosfolipidelor

(3.2.9) Determinarea activității α-secretazei și ADAM-10 după incubarea in vitro 25 (3.2.10) Determinarea conținutului de Aβ, sappβ și sappα. 26 (3.2.11) Determinarea conținutului ADAM-17, BACE-1 și PS-1. 27 (3.3.) Analiza lipidelor. 28 (3.3.1) Extracția lipidelor din creierul post-mortem uman. 28 (3.3.2) Măsurarea stabilității DHA. 28 (3.3.3) Determinarea conținutului de lipide prin spectrometrie de masă. 28 (3.3.4) Determinarea conținutului de fosfolipide prin cromatografie în strat subțire. 29 (3.3.5) Determinarea conținutului HNE. 30 (3.3.6) Determinarea peroxidării lipidelor. 30 (3.4) Analiza ARN. 31 (3.4.1) Izolarea ARN-ului. 31 (3.4.1) sinteza CDN și reacția în lanț a polimerazei în timp real (RT-PCR). 31 (3.5) Evaluare statistică. 32 (4) publicații. 33 (4.1) Rezumatul publicației 1 și descrierea coplății. 33 (4.2) Rezumatul publicației 2 și descrierea coplății. 69 (4.3) Rezumatul publicației 3 și descrierea coplății. 87 (5) Rezumat extins. 102 (5.1) Lipide în AD. 102 (5.2) În context: fosfolipide, DHA și lipide oxidate în procesarea APP și rolul lor în AD. 104 (6) Rezumat și Outlook. 117 (7) Participarea la alte publicații. 119 (8) Bibliografie. 121 (C) Mulțumiri. 133

Abrevieri (B) Abrevieri C grade Celsius µm micro molar AA acid arahidonic Aβ amiloid β AD Boala Alzheimer ADAM α-secretaza A-dezintegrină-și-metaloprotează AICD intracelular APP-domeniu Aph engl. APO E apolipoproteină E-proteină precursoare amiloidă proteină BACE β-secretază BSA albină serică bovină COX ciclooxigenază CTF Domeniu C-terminal al APP DHA acid docosahexaenoic DMEM Dublecco modificat mediu de vultur ADN acid dezoxiribonucleic ECE endotelină convertitoare ECE Acid etilen glicol tetraacetic EOAD Formă timpurie a bolii Alzheimer EPA Acid eicosapentaenoic FAD Formă familială a bolii Alzheimer FCS Ser de vițel fetal g/g gram/accelerație datorită gravitației GSK3β Glicogen sintază kinază 3 ore HBSS Soluție tampon salină pentru neuroni primari 3 H-Hidroxi-HM-HDC 3-metilglutaril coenzima A reductaza 5

Abrevieri HNE 4-Hydroxynonenal HPLC cromatografie lichidă de înaltă performanță IDE Enzimă degradantă insulină IP imunoprecipitare LDH lactat dehidrogenază Măsurare LDL lipoproteină cu densitate scăzută ÎNCĂRCARE Formă târzie a bolii Alzheimer LOX lipoxigenază LRP1 receptor lipoproteină 1 min minut Me metanol 40 mm milimolar NP-40 soluție NP-40 P-40 1 neuroprotectină-D1 NTF încurcături neurofibrilare OD densitate optică P valoare P, nivel de semnificație PBS soluție salină tamponată cu fosfat PC fosfatidilcolină PE fosfatidiletanolamină PL plasmalogen PS fosfatidilserină PSEN engl. Amplificator de presenilină RIP Proteoliză intramembrană reglementată RNS acid ribonucleic RT temperatura camerei RT-PCR reacție în lanț în timp real a polimerazei SAD Formă sporadică a bolii Alzheimer Sapp solubil APP s Al doilea SDS sodiu dodecil sulfat PAGINĂ poliacrilamidă gel electroforeză SPT serină palmitoil-coenzimă sălbatică Wtiobarază Wtiobarază

Introducere După ce a-secretaza a fost tăiată, αctf legată de membrană este scindată de γ-secretaza, care eliberează fragmentul mic p3 în AICD citosolic și extracelular. Spre deosebire de calea amiloidogenă, AICD din calea neamiloidogenă este degradată în interiorul celulei, printre altele, de enzima de degradare a insulinei (IDE), motiv pentru care relevanța transcripțională a acestui AICD este controversată (Belyaev și colab. 2010). Funcția p3 este încă neclară. O imagine de ansamblu asupra procesării APP este prezentată în Figura 1. Figura 1 Reprezentarea schematică a procesării APP, modificată din (Grimm, Rothhaar & Hartmann 2012). Prelucrarea neamiloidogenă, prezentată mai sus în dreapta, este preluată de α- (verde) și γ-secretază (albastru). Sappα solubil și αctf pe bază de membrană sunt formate inițial. Apoi se formează p3 și AICD. Aβ este marcat cu roșu în APP. Procesarea amiloidogenă este prezentată în partea stângă jos. Β-secretaza taie APP rezultând sappβ și βctf. Apoi Aβ și AICD sunt eliberate de γ-secretaza. 16

Publicațiile lipidelor din celule și membranele izolate, care au fost realizate de S. Grösgen (figura S5), am efectuat incubațiile lipidelor. Pentru determinarea conținutului de PC, PE și PS prin cromatografie în strat subțire, care a fost efectuată de B. Hundsdörfer (figura S2), și determinarea profilului lipidic, efectuată de S. Grösgen (tabelul S5), am membranele din SH -Celule SI5Y și creiere umane post-mortem izolate. Am efectuat analiza statistică a datelor folosind ANOVA în colaborare cu V. Zimmer și J. Lehmann (figura 1-4, tabelul S1-4). Publicația 1 se găsește mai jos. Originalul publicației poate fi găsit pe site-ul web al editorului MDPI AG (Basel, Elveția), www.mdpi.com/journal/ijms, sub numărul doi: 10.3390/ijms14035879. 35

Supliment Rothhaar și colab. Publicații Fig. S1 Citotoxicitate după incubarea lipidelor Fig. S2 Controlul specificității în testul de -secretază Fig. S3 Controlul specificității în testul de -secretază citotoxicitate n.s. fluorescență (-secretază activitate) [RFU] control + -secretază inhibitor fluorescență (-secretază activitate) [RFU] control + -secretază inhibitor PC 22: 6 PC-PL 22: 6 PE 22: 6 PE-PL 22: 6 0 2000 4000 6000 8000 timp [sec] 0 1000 2000 3000 4000 5000 timp [sec] Fig. S4 Controlul specificității în -secretază analiză fluorescență (-secretază activitate) [RFU] control + -secretază inhibitor 0 2000 4000 6000 timp [sec] 86

Publicații Pe lângă analiza în celulele vii, am efectuat incubația membranelor din celulele SH-SY5Y și măsurarea ulterioară a activității β-secretazei și am evaluat datele statistic (Figura 2c). Determinarea expresiei secretazelor a fost efectuată de J. Mett în urma incubării celulelor cu lipide oxidate (figura 2d). T. Blümel a determinat activitatea β- și γ-secretazei după incubare cu DHA (rezultă în text) și C. Stahlmann stabilitatea DHA (rezultă în text); Am efectuat incubarea cu lipide pentru ambele analize. Evaluarea statistică a nivelurilor de Aβ după incubarea cu DHA și lipide oxidate a fost efectuată de N. Mylonas (rezultate în text). Publicația 3 poate fi găsită mai jos. Originalul publicației poate fi găsit pe site-ul web al editorului S. Karger AG (Basel, Elveția), www.karger.com/ndd, sub numărul doi: 10.1159/000440839. 89