Semnalul cheie al calciului se declanșează în timpul invaziei Plasmodium a eritrocitelor
Subiecte
Abstract
introducere
Aici, generăm anticorpi monoclonali (mAbs) împotriva regiunii de legare a eritrocitelor RII-3 a PfRH1 (un membru al familiei RH a P. falciparum 7). Arătăm că mAbs PfRH1 blochează invazia merozoitelor prin inhibarea specifică a semnalizării calciului în parazit, mai degrabă decât prin interferența directă cu legarea eritrocitară a parazitului. Arătăm în continuare că inhibarea acestei semnalizări de calciu previne descărcarea de EBA175 și astfel previne formarea joncțiunilor (un pas cheie care permite parazitului să intre în eritrocit folosind un motor pentru a activa-miozina 3). Rezultatele noastre demonstrează că PfRH1 și EBA175 au funcții distincte, PfRH1 având un rol inițial de detectare și transducție a semnalului, ceea ce duce la eliberarea ulterioară a EBA175 din micronem și la formarea joncțiunilor. Aceste noi cunoștințe ar putea ajuta la identificarea de noi ținte pentru o intervenție antimalarică.
Rezultate
MAb-urile specifice PfRH1 inhibă invazia merozoitei
În această lucrare, folosim PfRH1 pentru a studia principalele evenimente de semnalizare intracelulară care duc la invazia eritrocitară cu succes. Am arătat anterior că anticorpii care vizează o regiune de legare a eritrocitelor (RII-3) a PfRH1 (Fig. 1a) pot inhiba invazia merozoitei 7. Aici, am generat patru anticorpi monoclonali (Acb: C49, C41, C2 și C50) împotriva acestei regiuni și le-am validat specificitatea utilizând teste Western blot și imunofluorescență. Toți anticorpii recunosc forma așteptată PfRH1 tratată cu 240 și 140 kDa în extracte de supernatant, merozoiți și schizonti din cultura parazitară T994, în timp ce nu s-a detectat nicio bandă echivalentă în linia de inactivare T994ARHH1 din PfRH1 (Fig. Suplimentară S1a - c). Testele de imunofluorescență au arătat că toți mAbs au dat motive punctuale parțial localizate cu EBA175 (o proteină micronemă cunoscută) la capătul apical al merozoiților în T994, care corespunde locației prezise a PfRH1 (Fig. S1d suplimentar). Nu s-a observat nici o colorare în T994ΔRH1 (Figura suplimentară S1e), confirmând în continuare specificitatea mAbs.
( la ) PfRH1 de lungime completă, incluzând secvența semnalului (SS, roșu), regiunea de legare a eritrocitelor RII-3 (albastru, cuprinzând aminoacizii 500-833) și domeniul transmembranar (TM, galben). ( , vs. ) Testele de inhibare a invaziei folosind mAbs anti-PfRH1 (IgG) în T994 ( ) și T994ΔRH1 ( vs. ). Graficele cu bare arată media ± săptămână; n = 3. * P ≤0.0003 de către ANOVA unidirecțional, indicând faptul că C49 a reușit să blocheze invazia T994 comparativ cu invazia în prezența C2 și C50. + P ≤ 0, 0003 prin ANOVA unidirecțional, indicând faptul că C41 a inhibat semnificativ invazia comparativ cu C2 și C50.
Imagine la dimensiune completă
MAbs inhibitori blochează invazia înainte de formarea joncțiunii
Imagine la dimensiune completă
MAbs inhibitori ai PfRH1 blochează semnalizarea Ca 2+ în timpul invaziei
Imagine la dimensiune completă
Viabilitatea merozoiților
Imagine la dimensiune completă
Un inhibitor EBA175 mAb nu are niciun efect asupra semnalizării Ca 2+
În concordanță cu datele publicate, rezultatele noastre indică faptul că PfRH1 are un rol direct în eliberarea de Ca 2+, care ulterior declanșează secreția de microneme și EBA175. Dacă acest lucru este într-adevăr corect, ne-am aștepta ca blocarea funcției EBA175 și, prin urmare, formarea joncțiunilor să nu aibă niciun efect asupra semnalizării Ca 2+. Pentru a investiga mai departe acest lucru, am folosit mAb R215 de blocare a invaziei, care vizează regiunea EBA175 II (ref. 30). După cum s-a descris anterior, mAb R215 este capabil să blocheze invazia în funcție de doză, cu o inhibare maximă de aproximativ 47,7% ± 1,11 la 0,25 mg ml -1 (Fig. 5a) 30. Cu toate acestea, acest anticorp nu are niciun efect asupra semnalizării intracelulare Ca 2+ în timpul invaziei (Fig. 5b, date suplimentare 1-6). Acest rezultat confirmă faptul că anticorpii anti-invazie care vizează EBA175 acționează după semnalizarea Ca 2+, în timp ce cei care vizează PfRH1 acționează înainte de semnalizarea Ca 2+ și evidențiază în mod clar rolurile diferite jucate de PfRH1 și EBA175.
( la ) Test de inhibare a invaziei folosind un anti-EBA175 mAb R215 în paraziții T994. Diagramele cu bare arată inhibarea invaziei diferitelor concentrații (0,25-0,008 mg ml -1) ale mAb R215 specific EBA175 în T994. Graficele cu bare arată media ± săptămână; n = 3. ( ) Nivelurile de Ca 2+ citosolice au fost detectate folosind un cititor de plăci de fluorescență. Merozoiții T994 preîncărcați cu Fluo-4AM au fost incubați cu eritrocite în absență (RBC) sau în prezența R215 (RBC + R215 (0,2 mg ml -1)). Ca control pozitiv a fost utilizat ionoforul Ca 2+ A23187 (RBC + A23187). Modificările nivelurilor citosolice de Ca 2+ în timpul invaziei merozoite au fost evaluate în timp folosind un cititor de plăci de fluorescență. ≤ΔF (t) care reflectă modificările totale ale nivelurilor de Ca2+ citosolic la merozoiți au fost reprezentate grafic în funcție de timp (i). Datele experimentale au fost prezentate ca medie ± săptămână; n = 3.
Imagine la dimensiune completă
Inhibitorul de PfRH1 mAbs blochează expresia EBA175
Imagine la dimensiune completă
$ config [ads_text16] nu a fost găsit
Discuţie
În viitor, acum va fi important să se determine în continuare mecanismul prin care semnalul mediat de RH este transmis către merozoit pentru a declanșa eliberarea de Ca 2+. În ansamblu, rezultatele noastre oferă noi informații despre cascada de semnalizare reglată fin, care este necesară pentru a asigura invazia cu succes a merozoitului și pentru a deschide o cale pentru analiza căilor de semnalizare implicate în secreția reglementată a organitelor apicale în timpul invaziei. Împreună, acest lucru ne va oferi o mai bună înțelegere a mecanismelor de semnalizare importante în invazia merozoitei și a modului în care aceste procese ar putea fi o nouă țintă pentru intervenția împotriva malariei.