Studiul funcțiilor spectrinei α non-eritroide - PDF descărcare gratuită

Studiul funcțiilor spectrinei α non-eritroide Sylvain Metral Pentru a cita această versiune: Sylvain Metral. Studiul funcțiilor spectrinei α non-eritroide. Biochimie [q-bio.bm]. Université Paris-Diderot - Paris VII, 2009. franceză. HAL Id: tel-00377569 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00377569 Depus la 22 aprilie 2009 HAL este o arhivă multidisciplinară cu acces liber pentru depunerea și diseminarea documentelor de cercetare științifică, indiferent dacă acestea sunt publicate sau nu. Documentele pot proveni de la instituții de predare și cercetare din Franța sau din străinătate sau de la centre de cercetare publice sau private. Arhiva deschisă multidisciplinară HAL este destinată depunerii și diseminării documentelor științifice la nivel de cercetare, publicate sau nu, de la instituții de învățământ și cercetare franceze sau străine, laboratoare publice sau private.

U.F.R. Life Sciences INSERM UMR_S 665 Lamarck Building Institut National de la Transfusion Sanguine 35, rue Hélène Brion 6, rue Alexandre Cabanel 75205 PARIS CEDEX 13 75739 PARIS CEDEX 15 Teza de doctorat a Universității din Paris Diderot - Paris 7 Școala doctorală B2M Specialitatea Biochimie și biologie moleculară Structuri, funcție și inginerie a proteinelor Prezentat de Sylvain METRAL Pentru obținerea titlului de Doctor al Universității din Paris Diderot Paris 7 Studiul funcțiilor spectrului non-α Apărat luni 6 aprilie 2009 în fața juriului compus din prof. Fernando RODRIGUES-LIMA, Université Paris Diderot Dr. Elisabeth GENOT, INSERM U 889 Dr Faouzi BAKLOUTI, CNRS UMR 5534 Dr. Aziz EL-AMRAOUI, INSERM UMRS 587 Dr. Stéphane GASMAN, CNRS UPR 3212 Dr. Marie-Christine LECOMTE, INSER Examinator Examinator Director teză

În cele din urmă, aș dori să le mulțumesc tuturor familiei mele, părinților mei Josiane și Claude, fratele meu mai mic Didier și Catherine, care au putut întotdeauna să mă susțină în momente de îndoială. Cu aceste ultime rânduri, aduc un omagiu bunicilor mei, Adèle și Charles VIEUX JEANTON.

Cuprins

Introducere Figura 1: Imagine a rețelei de membrană spectrină obținută prin microscopie electronică (A). Reprezentarea schematică a acestei rețele (B) (după (Liu, S.C., Derick, L.H. și colab. 1987)). Nodurile rețelei corespund legăturilor dintre spectrină și actină. Proteinele prezente în nodurile rețelei sunt: aducină, tropomiozină, tropomodulină, aceste proteine controlează sau reglează interacțiunea spectrină-actină. Alte proteine prezente în aceste complexe proteice, cum ar fi proteinele 4.1 și p55, conectează spectrina la proteina transmembranară glicoforină C. Regiunea densă din mijlocul spectrului tetramer corespunde unui alt loc de interacțiune cu un complex proteic format din banda 3 și ankirină (Figurile 2 și 3 la pagina 15). Ankirina legată de banda 3 și de glicoproteina RHAG (proteine transmembranare) interacționează cu subunitatea β pentru a forma o a doua conexiune cu membrana plasmatică (Ungewickell, E. și Gratzer, W. 1978; Shotton, DM, Burke, BE și colab. 1979; Liu, SC și Palek, J. 1980; Winkelmann, JC și Forget, BG 1993; Delaunay, J. 2007). 14

Introducere Figura 2: Diagrama scheletului de membrană dependentă de spectrină în celulele roșii din sânge (imagine preluată din recenzia lui Xiuli An și Narla Mohandas (2008)). Figura 3: Descrierea nodurilor rețelei de spectrină din celulele roșii din sânge. În celulele roșii din sânge, rolurile scheletului de membrană și, în special, ale spectrinei sunt bine cunoscute: acestea oferă stratului lipidic un al treilea strat submembranar conferindu-i o rigiditate mai mare; joacă un rol important în forma, flexibilitatea și rezistența membranei. Aceste date 15

Introducere Unitățile care se repetă sunt conectate între ele printr-o helică lungă care corespunde, de fapt, cu helica C asociată cu helica A a următoarei unități de repetare. Această structură este foarte stabilă și rezistă proteolizei (DeSilva, T.M., Harper, S.L. și colab. 1997). Secvența primară a acestor unități repetate este slab conservată, cu excepția leucinei în poziția 26 din helixul C și a triptofanului 45 în helixul A (Figura 5 de mai jos). Figura 5: Reprezentarea alinierilor secvenței diferitelor unități repetitive ale spectrului αiσ1. Unitatea de repetare α1 începe de la helix A până la sfârșitul helixului C, apoi vine unitatea de repetare α2. Doar leucina 26 din helix C și triptofan 45 din helix A prezintă o conservare puternică. Secvențele prezentate deasupra săgeților negre reprezintă inserțiile a 8 aminoacizi care sunt implicați în formarea dimerului spectrin αβ. Alinierea obținută în teza lui Gaël NICOLAS, 199 preluată din articolul următor (Sahr, K.E., Laurila, P. și colab. 1990). 22

Introducere Figura 6: Reprezentarea diferitelor site-uri și domenii ale spectrului αii/βii (imagine preluată din articolul de M.A De Matteis, Jon.S Morrow (2000)). III.2.2.1.2 Situl de tetramerizare Scheletul membranei din celulele roșii din sânge este format din tetrameri de spectrină cu o lungime de 200 nm. Formarea tetramerului rezultă din interacțiunea dintre capătul NH2 al lanțului α și capătul COOH al lanțului β (Figura 6 de mai sus). Tocmai, această interacțiune implică helica C izolată din lanțul α înainte de prima unitate repetată α1 și helicile A și B din ultimele 24

Introducere ca biogeneză a membranelor laterale în celulele epiteliale (Kizhatil, K. și Bennett, V. 2004). S-a demonstrat, in vitro, folosind peptide recombinate că situsul de legare a ankirinei se găsește pe lanțul β și foarte precis pe helixul B al unității de repetare β15. Această spirală are o particularitate care este absența reziduului de triptofan 45 care este foarte conservat în celelalte spirale. Ankirina se leagă de lanțul β cu un Kd de 0,25 um (Kennedy, S.P., Warren, S.L. și colab. 1991). Figura 7: Reprezentarea unor proteine care interacționează cu dimerul spectrinului αii/βii (imagine preluată din articolul de M.A De Matteis, Jon.S Morrow (2000) și completată de rezultatele obținute în laborator. 27

Introducere Figura 9: Reprezentarea domeniului de mână EF al spectrinei (MOLSCRIPT), fără calciu legat (A) sau cu calciu (B) (imagine preluată din articolul lui G. Travé (Trave, G., Lacombe, PJ și colab.) III.2.2.2.4 Domeniul SH3 Lanțurile α au în bucla BC a unității de repetare α9 un domeniu SH3 (domeniul Src-Homology 3) (Wasenius, VM, Saraste, M. și colab. 1989) ( figura 10 la pagina 31). Lanțul β-h al nevertebratelor are și un domeniu SH3, celelalte lanțuri β lipsesc de acesta. Domeniul SH3 al lanțurilor αii este extrem de conservat, cu identitate 100% între oameni, șobolani, pui, Xenopus. Există o identitate de 74% între domeniul SH3 al lanțului αi și lanțul αii, la om, ceea ce înseamnă că structura sa tridimensională este bine conservată între cele două lanțuri α. Studiile cristalografice și RMN arată un domeniu cu două foi β care au trei catene β legate între ele într-un mod antiparalel (Musacchio, A., Noble, M și colab. 1992; Sadqi, M., Casares, S. și colab. 1999). Această structură formează o canelură hidrofobă mărginită de două bucle RT-Src și N-Src. Șanțul corespunde locului de interacțiune cu liganzii având: - secvențe bogate în prolină PXXPXR sau RXPXXP (cu X corespunzător oricărui aminoacid). 30