UN STUDIU EXPERIMENTAL DE ANIMALE PRIVIND VIVOTESTAREA BIODEGRADABILUL ÎNCĂRCAT DE FARMACONĂ
1 Clinică și policlinică pentru chirurgia generală, toracică, vasculară și de transplant a Universității Medicale din Rostock UN STUDIU EXPERIMENTAL PRIVIND TESTAREA IN VIVO A STENTURILOR DE POLILACTIDĂ BIODEGRADABILĂ ÎNCĂRCATE DE FARMACONĂ Disertație inaugurală pentru obținerea gradului academic de doctor în medicină al Universității din Rostock în Krasnodar. Rostock, 2007 urn: nbn: de: gbv: 28-diss
2 Decan: Prof. Dr. cu Wolfgang Schareck 1 recenzor: 2 recenzor: 3 recenzor:
3 În recunoștință față de părinții mei
4 CUPRINS. 1 1 INTRODUCERE Stenturi în chirurgia vasculară Indicații stabilite și stentare inovatoare a arterei carotide Stentul ideal Stent metalic Probleme de implantare a stentului: tromboză și restenoză Strategii de soluție Antitrombotice Stent metalic cu eliberare de medicament: Sirolimus Stenturi biodegradabile Stent metalic și stent polimeric cu eliberare de medicament MATERIALE METOD RELEASE Stenturi Testarea animalelor și managementul preoperator Anestezie, intubație și ventilație Monitorizare și medicație Procedură chirurgicală Modelul de anastomoză iliacă Modelul ACC Managementul postoperator și urmărirea Prelevarea de probe și histologie Evaluarea statistică REZULTATE Modelul de anastomoză iliacă Procedura chirurgicală Urmărirea Evaluarea histologică Modelul ACC Procedura chirurgicală Evaluarea histologică
5 5 DISCUȚIE Modelul porcului Proprietățile biologice și fizice ale stentului PLLA Testarea in vivo a stentului polimeric LISTA REZUMATĂ A LITERATURII LISTA ABREVIERILOR LISTA CIFRELOR LISTA TABELELOR PERFORMANȚE ȘTIINȚIFICE CURRICULUM DEFAULT CURENT
12 Funcția de sprijin a stentului metalic poate ajuta în mare măsură la prevenirea reculului elastic, dar nu poate inhiba hiperplazia neointimală, care este un alt factor decisiv în patogeneza restenozei stentului [47]. Fig.1: Restenoză in-stent datorată hiperplaziei neointimale, stânga: secțiune histologică, dreapta: imagine macroscopică în secțiune transversală, [prin amabilitatea MB Leon, Presbyterian Hospital, New York, SUA.] Aceasta arată reacția peretelui vasului la cele mai fine leziuni mecanice După denudarea endotelială, expunerea structurilor subendoteliale la fluxul sanguin duce la o reacție inflamatorie a peretelui vascular. Prin eliberarea citokinelor și a factorilor de creștere, cum ar fi factorul de creștere derivat din trombocite (PDGF), factorul de creștere epidermică (EGF), factorul de creștere ß transformant (TGF ß) și heparinazele, acest lucru duce la activarea și proliferarea celulelor musculare netede în tunică mass-media. După 9
14 grup de control [52]. Acoperirea locală cu heparină a stenturilor a fost stabilită clinic de la publicarea studiului BENESTENT II [53]. Acestea ar trebui să inhibe reacția inflamatorie a peretelui vascular și să blocheze proliferarea celulelor musculare netede. Tabelul 1: agenți farmacologici anti-inflamator pentru a reduce restenosis Immunodulatoren anti-migrare inhibitorii Proliferativa Reendothelisationsfaktoren dexametazona M-prednisolon interferon y-1b, leflunomidă, sirolimus, tacrolimus, everolimus zotarolimus micofenolic mizoribin ciclosporina actinomicină metotrexat angiopeptin, vincristina, mitomicina statine batimastat prolil hidroxilazei, inhibitori halofuginonă C-proteinaza, probucol BCP671 VEGF Estradiol NO donatori anticorpi EPC 11
22 Scorul de leziuni ale hiperplaziei neointimale Gradul de leziune a peretelui vascular Punctajul inflamator Gradul de inflamație Datele colectate sunt analizate, comparate între ele și discutate în legătură cu investigațiile in vitro ale stentului PLLA, care au fost înregistrate la Institutul de inginerie biomedicală de la Universitatea din Rostock. 19
23 3 MATERIAL ȘI METODE 3.1. Stenturile Stenturile metalice (Phainon 6,0 x 26 mm, diametrul strutului 155 m) au fost realizate din oțel inoxidabil (316L) cu un strat de carfură de siliciu amorf și apoi sterilizate cu gaz. Proiectarea corespunde sistemului PEIRON disponibil comercial (Biotronik GmbH & Co. KG, Berlin, Germania). Extinderea cu cateterul cu balon are loc în câteva secunde până la 8 bari, fără riscul ruperii stentului. Stenturile bioabsorbabile din poli-L-lactidă (PLLA) au fost dezvoltate și fabricate în Institutul pentru tehnologie biomedicală de la Universitatea din Rostock Warnemünde [16]. Fig. 2: Stent PLLA expandabil cu balon înainte (A) și după (B) dilatarea balonului Lungimea barei = 10 mm. 20
24 Pentru producție se utilizează lactidă poli L cu molecule mari (PLLA; Resomer L214, MG = g/mol, Boehringer, Ingelheim, Germania) fără aditivi. Într-un proces de acoperire controlat parțial, parțial automatizat (acoperire prin imersie), carcasele din miez din oțel inoxidabil (diametru 2,8 mm, lungime 40 mm) sunt coborâte într-o soluție PLLA/cloroform cu ajutorul unui robot de scufundare. Soluția este reumplută automat folosind un sistem de seringă pentru a se asigura că miezurile de imersie sunt umezite uniform. Procesul de scufundare se repetă până când se creează un sacou cu grosimea dorită a peretelui de 270 m. Aceasta se măsoară fără contact cu un cap de măsurare cu laser pe două axe (ODAC 32 XY, ZUMBACH Electronic, Orpund, Elveția). Tuburile de polimer sunt apoi îndepărtate din piston cu un bisturiu și uscate în vid la 40 ° C până când se atinge un conținut de cloroform mai mic de 2%. Un proces final de spălare cu apă și metanol este utilizat pentru a îndepărta cloroformul rezidual. Într-o a doua etapă, tuburile sunt apoi tăiate cu ajutorul unui laser cu CO2 (Wild Emco Lasertec, Hallein, Austria). Fig. 3: stânga: robot de scufundare, dreapta: laser CO2 21
25 Tăierile sunt controlate CNC. Pentru fixare, tuburile din polimer sunt așezate pe o mandrină ceramică care permite laserului să se deplaseze înainte, înapoi și în rotație. Toate căile de tăiere sunt traversate de două ori, astfel încât materialul să fie complet tăiat. Rezultatul final sunt stenturi PLLA cu o dimensiune de mm și un diametru de strung de 270 m, care sunt finalizate într-o etapă finală prin pulverizarea unei soluții PLLA Sirolimus într-un raport de 70:30, acoperirea prin pulverizare a medicamentului. Fig.4: Acoperire prin pulverizare - pulverizarea soluției de acoperire Compoziția soluției rezultă din testele preliminare care au arătat că sirolimus a fost eliberat doar la o concentrație de cel puțin 20% [16]. Acoperirea Pharmakon rezultată este de aproximativ 1,5 g/mm 2. Până la utilizarea stentului, acesta este depozitat într-un loc uscat la 20 C pentru a prelungi durata de valabilitate. Deoarece sterilizarea este asociată cu o reducere a proprietăților viscoelastice [15, 16], acest lucru nu se realizează. Dezinfectarea de un minut a stentului cu etanol are loc imediat înainte de implantare. 22
31 Procesul de anastomoză este realizat exclusiv de către același chirurg (C.M.B.) cu ajutorul unei lupe prismatice cu mărire de 2,5x, pentru a garanta cea mai mare standardizare posibilă a tehnicii chirurgicale. Fig.6: Implantarea unei proteze de bifurcație aortobiiliakal; situs intraoperator. Implantarea stentului este randomizată. În paralel cu preparatele pentru stent (3.1.), Membrul proximal (colier Satinski) și distal (colier Bulldog) al arterei iliace comune sunt fixate pe animal, precum și o incizie transversală lungă de aproximativ 0,5 cm a membrului protezei strânse la o distanță de 2 cm proximal de anastomoză. Ambele părți ale vasului sunt spălate prin incizie și spălate cu sare de masă cu heparină. După pre-întindere cu un Overholt, stentul sertizat pe un cateter cu balon de 6/40 mm (PHERON, Biotronik, Berlin, Germania) este introdus în mijlocul zonei de anastomoză și extins treptat sub control vizual. 28
32 Fig. 7: Implantarea stentului sub control vizual Stentul este dilatat prin umflarea cateterului cu balon la 8 bari. Așa cum s-a descris mai sus, stentul metalic este extins în câteva secunde, în timp ce extinderea stentului PLLA durează 8 minute (1 bar/min). După repoziționarea cateterului, incizia necesară pentru acces este închisă cu suturi cu un singur buton (Prolene 6.0 BV) și artera iliacă comună este expusă după îndepărtarea buldogului. În cele din urmă, parametrii vitali ai animalului sunt verificați. 29
33 Fig. 8: Inflația stentului anastomotic iliac, care este vizibil macroscopic prin peretele vasului. După ce stenturile au fost introduse cu succes în vase, cateterul arterial este îndepărtat și aorta este închisă cu Prolene. Aceasta este urmată de administrarea intravenoasă a 1,5 g ampicilină/sulbactam (Unacid) și clătirea abdomenului cu o soluție de gentamicină NaCl, ambele pentru profilaxia antibacteriană. După îndepărtarea cateterului urinar suprapubic cu închidere cu o sutură Z (Vicryl 3.0 SH) și repoziționarea buclelor intestinale, retroperitoneul este închis progresiv cu un 3.0. Sutura Vicryl și peritoneul s-au închis cu Mersilene. Sutura subcutanată se face, de asemenea, cu o funcționare 3.0. Sutura Vicryl, pielea este suturată cu fir absorbant după dezinfectare cu soluție de iod. În plus, 40 mg de enoxaparină (Clexane) și 5 ml de antibiotic cu spectru larg oxitetraciclină (Terramicină, Pfitzer Animal Health, Exton, SUA) se administrează subcutanat în mușchii gluteali. 30
35 se administrează o dată dimineața și seara. Porcul este transportat înapoi la casa de animale. Sonografie Doppler: Examinările sonografice Doppler ale vaselor aortoiliace se efectuează intraoperator (după proteze și după implantarea stentului) și la două și șase săptămâni după implantare. Debitul sanguin arterial femural maxim (Fmax, khz) este determinat folosind tehnica undelor continue pentru a evalua proprietățile de curgere ale anastomozei distale. Fig. 9: Examen sonografic Doppler al fluxului sanguin femural Tomografie computerizată: Pentru a determina permeabilitatea stenturilor în timp, examinările tomografice computerizate asistate de agent de contrast (Tomoscan AV, Philips Germania; Aquileon TSX 101A, Toshiba, Germania) ale vaselor aorto-iliace se efectuează după unul, două, patru și șase săptămâni folosind volumul 32
36 tehnica de redare (VRT), care permite afișarea simultană a suprafețelor și structurilor și proiecția de intensitate maximă (MIP), o tehnică de vizualizare volumetrică specială. Animalele au fost utilizate pentru investigații ca la punctul 3.3. descris, sedat. Fig. 10: CT regiune aorto-iliacă. Ambele stenturi sunt continue. Săgeată mare: stent metalic, săgeată ruptă: stent PLLA (nu radiopac) Eșantionare și histologie: Pentru a putea evalua secțiunile vasculare și perivasculare din zona stentului din punct de vedere histomorfologic și planimetric, secțiunile vasului stent, precum și zonele de tranziție la proteză sau la nava nativă a explantat după o perioadă de 6 săptămâni. 33
38 Nivelul 1: Nivelul 2: Nivelul 3: Proximalul stentului și protezei de anastomoză Sutura anastomozei Distalul stentului și vasului de anastomoză Probele vaselor sunt tăiate cu o grosime a stratului de 10 m, colorate într-o soluție de hematoxilină/eozină (H.E.) și uscate. Histoplanimetrie: Pentru a putea evalua secțiunile histologice morfometric, acestea sunt fotografiate cu un sistem de camere digitale pentru microscopuri (Axioskop 40, Axio Cam MRc5, Carl Zeiss, Hamburg, Germania) și transferate pe un computer. Toate secțiunile sunt digitalizate pentru analize planimetrice și evaluate cu software-ul Image J (versiunea 1.32j) de pe site-ul web al institutului național de sănătate (. Pentru a evalua permeabilitatea post-intervențională a vaselor, diametrul lumenului rezidual (RL, mm) în nivelurile 1, 2 și 3 în șase măsurători, bazate pe limita neointimală pe partea lumenului, determinată la un unghi de 60% și calculată din media aritmetică. Hiperplazia neointimală este determinată din grosimea medie intimă (MID, mm), care este deasupra struturilor la nivelul 3 a fost măsurată, determinată 35
39 Histomorfologie: Evaluarea histomorfologică este efectuată de doi examinatori independenți care sunt orbi de prezența sirolimusului în stenturile PLLA. Scorul vătămării Pentru a evalua semi-cantitativ amploarea vătămării peretelui vascular cauzat de stent, se examinează 4 incizii consecutive distale de anastomoză cu ajutorul unui microscop cu lumină și se creează un indice de vătămare. Fiecare strut individual al unei secțiuni este evaluat și se atribuie scoruri numerice (0 3): 0 lamina elastica interna (LEI) intactă, mediul tunica nu este comprimat, nici o leziune 1 LEI intactă sau ușor lacerată, mediul comprimat, nu lacerat 2 LEI și tunica media lacerată, adventitia intactă 3 lamina elastica externa (LEE) perforată, adventitia deteriorată sau perforată. Toate scorurile sunt adăugate și împărțite la numărul de struturi evaluate pentru a obține scorul de prejudiciu pentru întregul stent [48]: Scorul de leziune (IS) = suma tuturor scorurilor, numărul de struturi evaluate 36
40 Scor inflamator Această clasificare a scorului este utilizată pentru a înregistra amploarea și densitatea reacției inflamatorii a țesutului după implantarea stentului. În acest scop, fiecare strut individual este examinat semicantitativ pentru apariția celulelor inflamatorii în patru incizii succesive distale de anastomoză și se atribuie scoruri numerice (0 3): 0 fără celule inflamatorii 1 ușoară infiltrare subintimală a limfocitelor și histiocitelor 2 agregate celulare locale moderate până la dense 3 infiltrare densă a Limfocite și histiocite care înconjoară întregul strut Scorul inflamator pentru întregul stent rezultă din suma scorurilor individuale împărțite la numărul de struturi evaluate [93]. IF = suma tuturor scorurilor număr de puncte evaluate 3.8. Evaluare statistică: parametrii de bază ai operației și datele histologice sunt prezentați în deviația medie +/- deviația standard. Diferențele sunt comparate statistic folosind testul T cu două cozi nepereche. Reprezentarea măsurătorilor ultrasunetelor Doppler folosind media aritmetică. Datele 37
44 Sonografie Doppler de urmărire: După implantarea protezei, sonografia Doppler cu unde continue arată o scădere a amplitudinii fluxului sanguin sistolic, care este inversată prin implantarea stentului. După șase săptămâni, nu a existat nicio scădere hemodinamică a fluxului sanguin femural în grupul de stenturi PLLA acoperite cu metal și sirolimus. În contrast, există o scădere a Fmax în grupul de stenturi PLLA. Tomografie computerizată: Toate grupurile stentate au un lumen deschis la tomografia computerizată după 6 săptămâni. Grupul PLLA neacoperit prezintă nereguli care indică stenoza. În schimb, un flux arterial aproape netulburat poate fi văzut în grupul Sirolimus PLLA. Evaluarea lumenului după stentarea metalului este problematică deoarece metalul produce artefacte în tomografia computerizată. 41
45 Fig.11: CT aortoilical. Ambele picioare ale protezei și AIC sunt deschise (metal drept, PLLA stâng). În zona stentului PLLA, există nereguli care duc la o îngustare moderată a lumenului. Evaluare histologică Toate segmentele purtătoare de stent sunt continue, nu există ocluzie trombotică. Evaluarea histologică nu arată nicio dovadă a reculului excesiv sau a colapsului unui stent. O incizie circulară intactă poate fi găsită la toate exemplarele. 42
46 Fig. 12: Secțiune histologică care prezintă dovezi ale stenturilor metalice deschise (*) și PLLA (**). O hiperplazie neointimală poate fi văzută deasupra puntilor de stent (S), care este mai pronunțată în PLLA. Colorare HE, mărire originală 12,5 x. Fig. 13: Secțiunea histologică a unui stent SIR-PLLA. Există doar o hiperplazie neointimală minimă peste stent (S). este. Colorare HE, mărire originală 12,5 x. 43
50 Evaluare histologică: toate segmentele stentate prezintă un lumen deschis, nu a existat ocluzie trombotică în seria de teste. Evaluarea histologică relevă o incizie stent circulară intactă în toate segmentele, nu există nicio indicație de recul excesiv sau colapsul unui stent. Fig. 17: Secțiune histologică în zona ACC, metal în stânga, PLLA în dreapta. Se poate observa formarea unei neointime peste stenturile (S), care este mai pronunțată în PLLA. Colorare HE, mărire originală 12,5 x. 47