Analiza expresiei genice în sonde de cenușă de smarald (Agrilus planipennis) folosind cantitativ real

rezumat

PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR) este un instrument eficient pentru diagnosticarea nivelurilor de ARNm în diferite țesuturi de insecte și stadii de dezvoltare. În acest raport, am demonstrat utilizarea qRT-PCR pentru a determina nivelurile de ARNm în diferite țesuturi larvare și stadii de dezvoltare ale speciilor de insecte invazive, sonde de cenușă smarald.

Abstract

Borcanul de cenușă de smarald (EAB, Agrilus planipennis) este un dăunător invaziv exotic care a ucis milioane de frați (Fraxinus spp) din America de Nord. EAB continuă să se răspândească rapid și atacă frasinul de diferite vârste, de la puieți la copaci. Cu toate acestea, până în prezent există foarte puține sau deloc cunoștințe moleculare pentru EAB. Suntem interesați să descifrăm baza moleculară a proceselor fiziologice în țesuturi care ajută EAB la colonizarea cu succes a frasinilor. În acest raport, arătăm utilizarea eficientă a PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR) pentru a verifica nivelurile de ARNm în diferite stadii ale țesutului larvar (inclusiv corpul adipos al intestinului și cuticula) și diferite stadii de dezvoltare (inclusiv 1 St -, 2 Nd -, 3 Rd, 4 stele, prepupae și adulți) de la EAB. De exemplu, o genă peritrofină (denumită aici, AP-PERI1) este utilizată ca genă de interes și un exemplu de proteină ribozomală (AP-RP1) este utilizat ca control intern. Peritrofinele sunt componente importante ale membranei/matricei peritrofice (PM), care este mucoasa intestinelor insectelor. PM are diferite funcții, cum ar fi digestia și protecția mecanică a epiteliului midgut.

Protocol

Protocolul complet cu diferiți pași arătați în diagrama de flux din Figura 1. Etapele individuale sunt disecția, extracția ARN-ului, sinteza cADN-ului First Strand și qRT-PCR sunt descrise mai jos.

II. Extracția ARN (conform protocolului producătorului pentru utilizarea reactivului Trizol)

1. Pentru a începe extragerea ARN-ului, utilizați mai întâi ciururi din plastic pentru a omogeniza țesuturile din Trizol cu ​​1,5 ml tuburi Eppendorf. După omogenizare, aduceți volumul total al fiecărei probe la 1 ml cu reactivul Trizol.
2. Pentru etapele de dezvoltare, omogenizați animalul întreg în azot lichid cu un mortar de pistil. Apoi adăugați o parte alicotă a omogenatului (50 ug) la 1 ml de Trizol.

1. Se incubează eprubetele cu 1 ml Trizol timp de 15 minute la temperatura camerei.
2. După incubare, adăugați 200 μl de cloroform în fiecare tub. Imediat după adăugarea cloroformului și agitați puternic tuburile timp de aproximativ 15 secunde. Apoi păstrați tuburile la temperatura camerei încă 2-3 minute.
3. Apoi, centrifugați probele la 12.000 xg timp de 15 minute la 2 ° C. După centrifugare, ARN-ul se află în faza apoasă. Volumul fazei apoase ar trebui să fie de 600 μl sau 60% din volumul total de Trizol.

1. Îndepărtați cu atenție doar faza apoasă. Prezența substanțelor sub faza apoasă va contamina ARN-ul extras. Apoi transferați faza apoasă într-un tub Eppendorf de 1,5 ml marcat corespunzător.
2. Pentru a precipita ARN-ul din faza apoasă, amestecați 0,5 ml alcool izopropilic în fiecare tub. Se incubează probele la temperatura camerei timp de 10 minute. După incubare, centrifugați la 12.000 xg timp de 10 minute la 2 ° C.

1. După centrifugare, aruncați supernatantul din tuburi. ARN-ul se formează în peleta asemănătoare gelului de la baza tubului. Se spală peleta cu 75% etanol, adăugând cel puțin 1 ml de 75% etanol la 1 ml de Trizol. Se amestecă prin vârtej. Apoi centrifugați la 7500Xg timp de 5 minute la 2 ° C.

1. Aruncați supernatantul din tuburi. Centrifugați din nou în centrifuga de masă mică timp de 1 minut. Îndepărtați excesul de supernatant din tub prin pipetare atentă. Lăsați tubul deschis și lăsați peleta să se usuce la aer timp de 5-10 minute. Asigurați-vă că aveți o peletă uscată, deoarece aceasta va reduce semnificativ solubilitatea acesteia.
2. După uscare la aer, peleta în pirocarbonat de dietil sau apă tratată cu DEPC. Cantitatea de apă utilizată pentru resuspendarea peletei depinde de mărimea peletei. Utilizați 50 μl de apă tratată cu DEPC pentru o peletă mică sau 100 μl pentru o peletă mare. Lăsați peleta să se dizolve complet în apă tratată cu DEPC glisând vârful pipetei în sus și în jos de mai multe ori.
3. Odată ce peleta s-a dizolvat, puneți proba la 55 ° C timp de 10 minute.
4. Apoi măsurați concentrația fiecărei probe de ARN cu un spectrofotometru Nanodrop (2 μl din proba de ARN).
5. Păstrați probele de ARN la -80 ° C până la utilizarea ulterioară.

III. Sinteza cADN-ului First-Strand (conform protocolului producătorului cu kitul de sinteză SuperScript First-Strand de la Invitrogen)

Proiectarea primară și determinarea genei de referință

Grund de proiectare cu o temperatură de topire (Tm) de 60 ° C și o dimensiune a produsului

100 bp.

AP-PERI1 este utilizat ca genă de interes pentru acest experiment. Este necesară o genă de referință sau un sistem de control intern pentru o analiză ulterioară și normalizarea datelor. Proteina ribozomală (AP-RP1) este utilizată ca genă de referință pentru acest experiment.

Pregătiți stocuri de lucru de 5um de grunduri care vor fi utilizate, inclusiv gena dvs. de referință.

Pregătirea standardelor

1. Pentru a calcula eficiența grundurilor utilizate trebuie făcute standarde.
2. Faceți un amestec de ADNc din diferitele probe care sunt testate.
3. Faceți diluții seriale de 5 ori pentru orice punct de pe grafic. Patru diluții ar trebui să fie suficiente, dar cinci sunt foarte recomandate.
4. Volumul variază în funcție de câte puncte și câte replici tehnice sunt utilizate. Ar trebui să fie suficient să se facă un standard pentru fiecare genă testată cu gena de referință adecvată.

1. Șablonul de proiectare arată numele eșantionului pentru fiecare godeu din placa qRT-PCR. Amintiți-vă că există standarde pentru fiecare genă și cel puțin două replici tehnice pe eșantion.

Configurați parametrii roții

1. Porniți mașina qRT-PCR și introduceți parametrii roții. Parametrii PCR pentru acest experiment sunt după cum urmează:
   Pasul 1:
   • 1 ciclu: 95 ° C 3 min
   Pasul 2:
   • 40 de cicluri: 95 ° C 15 sec, urmate de 60 ° C 30 sec
     (Opțional: includeți pașii următori pentru a determina curba de topire)
   Pasul 3:
   • 1 ciclu: 95 ° C 1 min
   Pasul 4:
   • 1 ciclu: 55 ° C 1 min
   Pasul 5:
   • 81 cicluri: 55 ° C 30 sec

Configurați placa pentru mașina CFX96 (BioRad)

V. Reprezentarea schematică a experimentului

Ilustrația 1: Organigramă care arată secvența pașilor pentru examinarea expresiei genelor.

Figura 2: A) Disecția larvelor EAB arată intestinul mediu în mijloc. B) intestin mediu izolat al larvelor EAB

Figura 3: A) Valorile medii ale expresiei relative (revoluții) pentru o genă peritrofină (AP-PERI1) în diferite stadii ale țesutului larvar, inclusiv cuticula (Cu), midgut (MG) și corpul gras (FB) O proteină ribozomală specifică EAB (denumită aici, AP-RP1) a fost utilizată ca control intern pentru normalizarea datelor obținute pentru gena de interes, AP-PERI1. B) Modificarea relativă a pliului în AP-PERI1 în țesuturile larvare. Țesutul cuticulei a prezentat cea mai mică expresie și, prin urmare, a fost utilizat ca probă de calibrare (1X) (Pfaffl, 2001).

Figura 4: A) Valori medii ale expresiei relative (revoluții) pentru o genă peritrofină (AP-PERI1) în diferite stadii de dezvoltare ale EAB, inclusiv stadii larvare (1, 2, 3 și 4), prepupa (PP) și adulți (A) O proteină ribozomală determinată de EAB (AP-RP1) a fost utilizată ca control intern pentru normalizarea datelor obținute pentru gena de interes, AP-PERI1. B) Modificarea relativă a pliurilor în AP-PERI1 în diferite etape de dezvoltare. Eșantionul de PP a prezentat cel mai scăzut nivel al nivelului de ARNm și, prin urmare, a fost luat ca un calibrator (eșantion 1X).

PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR) este un instrument eficient pentru diagnosticarea nivelurilor de ARNm în diferite țesuturi de insecte și stadii de dezvoltare. În plus, qRT-PCR are în principal instrumentul central pentru validarea datelor generate de analize ale expresiei genei cu randament ridicat, cum ar fi microarrays și noua generație de ARN-Seq.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Valoarea ciclurilor de prag (Ct) pentru fiecare probă este obținută pe placa qRT-PCR. Pentru a produce curba standard, valoarea Ct obținută pentru fiecare diluție a fost reprezentată grafic în raport cu concentrația. Valorile Ct pentru probele experimentale au fost apoi reprezentate grafic pe această serie standard de diluare a curbei. Cantitățile țintă au fost calculate din curbe standard separate generate pentru fiecare experiment, adică expresia țesutului și a dezvoltării. Valorile relative ale expresiei (rotații) au fost apoi determinate prin împărțirea sumelor secvenței țintă de interes (în acest caz AP-PERI1) cu suma obținută pentru sistemul de control intern (AP-RP1). Semnificativ pentru calcule, jurnalele REV-urilor pentru fiecare genă au fost analizate de ANOVA (Analiza Varianței) folosind procedura PROC MIXED de la SAS (SAS Institute Inc. SAS/STAT User Guide, Versiunea 9.1). Semnificația expresiei a fost necesară la p Abonament. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Nu s-au declarat conflicte de interese.

Mulțumiri

Recunoaștem ajutorul oferit de Lourdes Delta Arrueta Antequera (Departamentul de Entomologie, Ohio State University/OARDC, Wooster, OH) în înființarea experimentelor. Mulțumim Dr. Therese Poland (USDA, Forest Services, NRS) pentru trimiterea probelor de larve EAB. Ajutor oferit de Dr. Luis A Canas și Nuris M Acosta cu configurarea microscopului sunt apreciate. Finanțarea acestui proiect a fost obținută din fonduri de stat și federale furnizate de Centrul de Cercetare și Dezvoltare Agricolă din Ohio, Universitatea de Stat din Ohio.

---