Analiza in-vitro

Pentru multe studii care nu sunt posibile pe subiecții testați, procedurile de testare in vitro devin din ce în ce mai importante.

Pentru produsele cosmetice care sunt adesea utilizate pe o perioadă lungă de timp, testarea dermatologică pentru siguranță este o condiție esențială pentru un nivel ridicat de siguranță a aplicației și satisfacția clienților. Prin determinarea și evaluarea obiectivelor biologice fiabile și reproductibile pe baza analizelor histologice și biochimice, se poate face o declarație despre efectele unui produs asupra proceselor biologice regenerative ale pielii.

Modelul 3D de piele este deosebit de potrivit pentru o astfel de examinare, deoarece formează secvența histologică naturală a straturilor de celule epidermice și a structurilor dermice, așa cum se știe din epiderma umană. Stratul bazal, stratul de keratinocit bazal, se află direct pe un echivalent viu al dermului (fibroblaste) și este urmat histologic de stratul spinosum și stratul granulosum, care sunt în cele din urmă acoperite de straturile de celule cornene ale stratului cornos.
Tulburările cornificației epidermice regulate (ortokeratoza), cauzate de diverși stimuli de natură fizică (mecanică, UV-A/B) sau chimică (SLS), pot fi analizate și evaluate cantitativ și calitativ.

În studiile in vitro investigăm:

  • Integritatea barierei pielii/regenerarea după deteriorare,
  • Daune UVA/B,
  • Compatibilitatea produsului.

  • diferențierea epidermică,
  • Bariera cutanată a structurilor relevante,
  • vitalitate,
  • Integritatea zonei dermo-epidermice (DEJ),

  • Structuri morfologice-histologice după colorare specială,
  • Colorarea prin imunofluorescență a proteinelor implicate în diferențierea corneocitelor,
  • Cuantificarea interleukinelor (de ex. IL-1α, Il-6) utilizând testul imunoabsorbant enzimatic legat (ELISA),
  • alte metode în dezvoltare.

Analiza histologică

Histologia este știința țesuturilor biologice (histos = țesut & logos = predare). Cu ajutorul histologiei, modificările morfologice ale țesuturilor la nivel celular pot fi făcute vizibile prin colorare specifică și evaluate în consecință. Cea mai comună colorare utilizată în histologie și histopatologie este colorarea H&E. Aici, acizii nucleici sunt de culoare intens albastru închis, citoplasmă și țesut conjunctiv roz-roșu. Figura de mai jos prezintă o colorare H&E a unui model sănătos (A) și a unui model deteriorat (B) expus la UVB.

analiza

Colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) a unei secțiuni ultra-subțiri A) model netratat B) Model iradiat cu UVB (250 mJ/cm2) după 48 de ore. săgeți închise: celule arse de soare; săgeți deschise celule hidropice (acumulare masivă de fluid). *: Diskeratoză tipică (tulburare de cornificare) după expunerea la UV.

Modelul prezintă toate straturile fiziologice (strat bazal, spinosum, granulosum și corneum) ale pielii umane native, precum și o veritabilă cornificare (A). Figura B prezintă un model la 48 de ore după expunerea la UVB (250 mJ/cm2).
Caracteristicile tipice ale arsurilor solare sunt clar recunoscute. Numeroase așa-numitele „celule arse de soare” (săgeată închisă), celule hidropice, care conțin mai mult fluid și un nucleu mai puțin puternic colorat (săgeți deschise), precum și tulburarea tipică a cornificației (diskeratoza).
În plus, pot fi observate keratinocite izolate vacuolate. Folosind acest model, funcția de protecție (protecție solară) și/sau potențialul regenerativ al unei formulări sau substanțe individuale pot fi investigate și evaluate la nivel celular.

Analiza ratei diviziunii celulare

Rata diviziunii celulare (proliferare) este un indicator important al vitalității sau „aptitudinii” unui țesut. În epiderma umană, numai keratinocitele stratului bazal (keratinocite bazale) sunt capabile de diviziune celulară. Acestea compensează corneocitele pierdute prin procesul permanent de exfoliere, asigurând astfel homeostazia țesutului și prevenind subțierea celulară a epidermei.


Secțiune ultra subțire a unui model full skin. A) imagine cu câmp luminos B) imagine cu fluorescență. Albastru = nuclee celulare, roșu: celule care se divid.

Folosind tehnologia Click-It EdU®, cheratinocitele bazale ale epidermei și fibroblastele dermei pot fi marcate în mod specific (A + B) în modelul de piele în timpul diviziunii celulare (mitoză). Pe baza acestui fapt, se poate determina dacă o substanță sau o formulare influențează comportamentul diviziunii celulare după o aplicare locală sau sistemică definită și un timp de tratament.
Efectuarea unui control netratat permite cuantificarea procentului din rata diviziunii celulare. Exemple de activitate crescută de diviziune celulară: vindecarea rănilor, procese inflamatorii.

Integritatea barierei pielii

Un alt parametru important pentru o piele sănătoasă este o barieră intactă a pielii, care, pe de o parte, previne pierderile excesive de apă și, pe de altă parte, reprezintă un scut protector eficient împotriva agenților patogeni, a influențelor mediului și a substanțelor nocive (chimice).


Secțiune ultra subțire a unui model de piele completă. A) Tratament cu PBS steril B) Tratament de 45 de minute cu 1% SDS.
Albastru = nuclee celulare, verde: Lucifer Galben colorare.

Substanțele individuale, formulările complete sau noxele chimice pot afecta integritatea barierei cutanate. Acest lucru poate duce la pierderi crescute de apă (evaporare crescută) și absorbția agenților nocivi din mediu, care (pasiv) pătrund în piele. În modelul full-skin, culoarea Galben Lucifer prezentată poate fi utilizată pentru a examina dacă un produs afectează bariera pielii. Apa sterilă sau PBS (soluție salină tamponată cu fosfat) nu au niciun efect asupra integrității barierei (A). Vopseaua aplicată local rămâne complet în straturile superioare ale pielii (strat corneum).
Cu toate acestea, un tratament de 45 de minute cu surfactant SDS (1%) duce la deteriorarea barierei cutanate (B). Vopseaua pătrunde în straturile mai adânci ale pielii (dermă). Această metodă poate fi utilizată și pentru a investiga dacă un produs poate restabili funcția de barieră după deteriorare.