Analize in vitro și in vivo ale activității anticancerigene a curcuminei și decetenei curcuminei am
Din domeniul geneticii umane, medicinii teoretice și al biosciințelor sau medicina clinică a Facultății de Medicină a Universității din Saarland, Homburg/Saar Analize in vitro și in vivo ale activității anti-cancerigene a curcuminei și decetenei curcuminei pe melanomul malign murin Disertație pentru obținerea gradului de doctor în Științe ale naturii Facultatea de Medicină UNIVERSITY DES SAARLAND 2014 prezentat de: Indra Navina Dahmke b. pe: 1 decembrie 1979 în Koblenz
Ziua promoției: Decan: Prof. Dr. M.D. Menger primul reporter: Prof. Dr. E. Meese al doilea raportor: PD Dr. M.W. Laschke
În memoria tatălui meu care m-a introdus în știință
Cuprins I Cuprins 1. Rezumat. 1 2. Introducere. 5 2.1. Melanom malign. 5 2.2. Curcumina. 6 2.2.1. Proprietățile chimice ale curcuminei. 9 2.2.2. Farmacocinetica curcuminei. 10 2.2.3. Farmacocinetica curcuminei la om. 11 2.2.4. Îmbunătățirea biodisponibilității. 11 2.2.5. Toxicitate. 12 2.2.6. Farmacodinamica curcuminei la om. 12 2.2.7. Țintele moleculare ale curcuminei. 13 2.3. MiRNA. 15 2.4. Întrebare proprie. 18 3. Material și metode. 19 3.1. Consumabile de laborator. 19 3.2. Metode biologice celulare. 19 3.2.1. Liniile celulare utilizate. 19 3.2.2. Cultivarea celulelor. 19 3.2.3. Izolarea celulelor mononucleare periferice umane primare. 20 3.2.4. Numărul de celule. 21 3.2.5. Test WST-1. 22 3.2.6. Analize citometrice de flux. 22 3.2.6.1. Determinarea citotoxicității. 24 3.2.6.2. Determinarea fazelor ciclului celular. 25 3.2.7. Analiza microscopică a fluorescenței. 25 3.3. Metode biologice moleculare. 26 3.3.1. Izolarea ARN-ului din probele tumorale. 26 3.3.2. Analiza de mare randament a profilului mirna. 27 3.3.3. Analiza in silico a căilor de semnalizare celulară. 29 3.3.4. PCR cantitativ în timp real de la mirnas. 29 3.3.4.1. Transcriere inversă. 29 3.3.4.2. PCR cantitativ în timp real (qrt-pcr). 30
Cuprins III 4.2.2. Proliferarea și apoptoza în modelul camerei dorsale a pielii. 58 4.2.3. Creșterea tumorii și neoangiogeneza în modelul tumorii de flanc. 58 4.2.4. Exprimarea NF-κB în tumorile de flanc. 60 4.2.5. Profilul ARNm al tumorilor de flanc. 60 4.2.6. Exprimarea mirnelor relevante în liniile celulare ale melanomului. 64 4.2.7. Căi de semnalizare reglate putativ. 65 4.2.8. Mirna-205-5p ținte. 66 5. Discuție. 68 5.1. Efectele proceselor pirolitice asupra curcuminei. 68 5.2. Efectele curcuminei dietetice asupra melanomului. 71 5.3. Concluzie și perspectivă. 79 6. Bibliografie. 81 7. Mulțumiri. 94 8. CV. 95 9. Publicații. 96 10. Anexă. 97
Lista abrevierilor IV Lista abrevierilor Fig. Figura Akt protein kinase Akt, protein kinase B al. alii APC Allophycocyanin APS persulfat de amoniu Bcl-2 Limfom cu celule B 2 BDMC Bidemethoxycurcumin bp basepare BRAF v-raf murin sarcom oncogen viral omolog B1, serină/treoninprotein kinază B-Raf C carbon Ca calciu CD-C-CD-C kit tirozin kinază KIT Cl clorură c-myc myc mielocitomatoză oncogenă virală omologă COX-2 ciclooxigenază 2 CTLA-4 citotoxic antigenul limfocitului T 4 Cur, CUR curcumină redist. bidistilată DEPC dietilpiro DHC dihydrocurcumin DKC decetene curcumin DMC demethoxycurcumin DMSO demetil sulfoxid Acid deoxyribonuleic DNA dNTP deoxiribonucleozidă trifosfat DTT ditiotreitol dUTP 2-deoxiuridină 1 jumătate episod eficient 2-deoxiuridină tranziție 1 jumătate epiphosphate, precoce răspuns transcripțional ECG2-half-1-2-deoxiuridină tranziție, 5-la-1-trifosfat răspuns maxim proteină 50, concentrația transymptive-half-epiphosphate, 5-la-1 concentrației proteinei bifosfat 50 HER, EGFR receptor de factor de creștere epidermică umană/leucemie eritroblastică oncogenă virală omologă ESR1 receptor de estrogen alfa FACS triere celulară activată prin fluorescență FDA Food and Drug Administration g Gramm G1 Gap1 G2 Gap2
Lista abrevierilor V GFP proteină fluorescentă verde H hidrogen h oră Hepe 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] etansulfonic acid HIF-1α Hipoxie-factor inductibil-1alfa hsa Homo sapiens ICAM-1 aderență intercelulară proteină-1, CD54 IgG imunoglobulină G ip kinaza 1 asociată receptorului interleukinei-1 IRAK1 intraperitoneal i.v. intravenos IVM intravital fluorescence microscopy microscopy IκB inhibitor of kappa B kda kilodalton KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes kg kilograms body weight M 1 G malondialdehyde-DNA ma milliampere Me methyl group µg microgram µl microliter µm micrometer minute mg milligram mg magnesium micorna. mirisc mirna induced complex tăcere medie medie ml mililitru mm milimetru mmu Mus musculus mol Mol mrna messengerrna mtor mamifere țintă de rapamicină (serină/treonină protein kinază) n număr Na sodiu NF-κB factor nuclear-kappa beta ng nanogram nm nanometru O atom de oxigen ORA analiza supra-reprezentării
Lista abrevierilor VI p53 proteină tumorală 53 PAG poliacrilamidă gel electroforeză PBS posfat tamponat cu soluție salină PCAF P300/factor asociat PCP PCNA celulă proliferantă antigen nuclear PCR polimerază reacție în lanț PECAM, CD31 plachetă moleculă de adeziune a celulelor endoteliale PI propidiu iodură p. o. per os PPAR-γ peroxizom proliferator-enabled receptor-γ PTEN fosfatază și tensin omolog PYR curcumină pirolizată qrt-pcr reacție în lanț cantitativă în timp real polimerază ARN acid ribonucleic S sinteză vezi p. tu. vezi mai jos SDS sodiu dodecil sulfat Eroare standard SEM a specificității SP1 medie factor 1 transcripție Src Tirozinkinază Src (sarcom) T zi t tonă TBS-T soluție salină tamponată Tris și Tween 20 TE tampon Tris-EDTA TNF-α factor de necroză tumorală- alfa TPA 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetat Tris 2-amino-2-hidroximetil-propan-1,3-diol T-test T student Student ultrasound VAV proto-oncogen vav VCAM-1 molecula de adeziune a celulelor vasculare-1, CD 106 greutate/volum greutate pe volum Organizația Mondială a Sănătății OMS WST-1 solubil în apă tetrazolium-1 xg n-accelerație datorată gravitației de ex. de exemplu C grade Celsius
Rezumatul 2 și liniile celulare ale melanomului uman au avut loc prin reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (qrt-pcr). Analizele țintelor putative ale mirnelor reglementate de curcumina dietetică au arătat că acestea erau supra-reprezentate în căile de semnalizare celulară biosinteza O-glicanului, procesarea proteinelor în reticulul endoplasmatic și diferite căi de semnalizare asociate cancerului. Analizele Western blot au arătat că anti-apoptotic celulele B CLL/limfom 2 (Bcl-2) și antigenul nuclear celular proliferant (PCNA) au fost semnificativ reglate în jos în tumorile tratate cu curcumină ale acestor ținte. Pe scurt, rezultatele acestei lucrări au demonstrat că decetena curcumina, care este mai toxică pentru celulele canceroase decât curcumina, se formează prin degradare pirolitică în timpul gătitului normal în gospodărie. În plus, a fost demonstrată o schimbare fundamentală în semnătura mirna în melanoamele transplantate datorită curcuminei dietetice. Aici mmu-mir-205-5p a fost reglat cel mai mult. Influența curcuminei administrate oral pe o rețea importantă de reglementare a tumorilor a fost dovedită și subliniază beneficiul potențial al curcuminei în tratamentul melanomului malign.
Rezumatul 4 a fost îmbogățit în biosinteza o-glicanului, procesarea endoplasmatică a proteinelor din reticul și diferite căi legate de cancer. Analizele Western blot au arătat că dintre aceste ținte anti-apoptotice celulele B CLL/limfom 2 (Bcl-2) și antigenul nuclear celular proliferant (PCNA) au fost semnificativ reglate în jos în tumorile tratate cu curcumina. În concluzie, descoperirile acestei teze demonstrează că deketena curcumina, care se formează ca o consecință a degradării pirolitice în timpul gătitului obișnuit în gospodărie, prezintă o toxicitate mai puternică asupra celulelor canceroase în comparație cu curcumina. În plus, curcumina dietetică a provocat o modificare profundă a semnăturii mirna în melanomul gravat, mmu-mir-205-5p fiind reglat în mod semnificativ. Impactul curcuminei administrate oral pe o importantă rețea de reglementare a tumorilor a fost documentat și subliniază potențialul curcuminei în terapia melanomului malign.
Introducere 7 Fig. 2: Curcuma longa. A: Desenul plantei de curcuma (Köhler, 1887). B: Foto a rizomilor și a pudrei de curcuma. Curcumina disponibilă în comerț constă de obicei în aproximativ 80% curcumină și conține, de asemenea, intermediari de biosinteză vegetală cu un spectru similar de activitate, cum ar fi demetoxicircumina (
17%) și bidemetoxicurcumină (
3%) (Fig. 3). În timp ce curcumina este utilizată în principal ca aditiv alimentar colorant (E100, Natural Yellow 3) în Europa și SUA, consumul și utilizarea sa în medicina tradițională sunt răspândite în Asia de Sud-Est. De mai bine de 2000 de ani, curcumina a fost folosită în bucătăria tradițională asiatică ca principală componentă a curry-ului și pentru colorarea dulciurilor și este utilizată în tratamentul medical al infecțiilor și bolilor interne (Ammon, 1991; Eigner și Scholz, 1999). Cu o pondere de 80% (aproximativ 800.000 de tone în 2010), India este principalul producător mondial de turmeric, din care 90% este procesat în continuare pe piața internă (Universal Commodity Exchange, 2012). Consumul mediu este de 2,0-2,5 g curcumă pe zi și persoană și corespunde unui aport de curcumină de până la 100 mg (Chainani-Wu, 2003). În comparație, Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară din Regatul Unit estimează că 0,8-3,3 mg/kg greutate corporală pe zi sunt consumate de adulți (Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară, 2010).
Introducere 10 proporții diferite de trans-6- (4-hidroxi-3-metoxifenil) -2,4-dioxo-5-hexanal, acid ferulic, feruloil metan și vanilină (Wang și colab., 1997). Curcumina este ușor solubilă în solvenți organici precum alcooli sau demetil sulfoxid (DMSO), dar numai cu dificultate în apă. Acest lucru duce la o absorbție celulară redusă în intestin și, în consecință, la o biodisponibilitate redusă. 2.2.2. Farmacocinetica curcuminei Studiile preclinice și clinice privind farmacocinetica curcuminei au arătat biodisponibilitate sistemică scăzută și metabolizare rapidă la prima trecere și excreție a substanței primare. Unul dintre primele studii efectuate de Wahlström și Blennow (1978) a arătat că curcumina administrată oral la șobolanii Sprague-Dawley este transportată activ din ficat în bilă și 75% este excretată cu fecale. Doar o mică proporție a fost detectabilă în plasmă și urină. Fig. 6: Metabolismul curcuminei (modificat din Sharma, 2005) .Excreția biliară a curcuminei este la rândul ei mediată prin proteina 2 asociată rezistenței multidrog (MRP2) (Lee și colab., 2012). Experimentele in vitro au fost, de asemenea
Material și metode 21 spălate cu PBS rece și celulele apoi numărate manual într-o cameră de numărare Neubauer (hemocitometru). Tampon de liză eritrocitară: 788 mg (10 mm) Tris-HCI 4,41 g (165 mm) substanțe chimice NH 4 Cl în 500 ml acv bidist. se dizolvă și se păstrează la 4 C. 3.2.4. Numărarea celulelor Pentru a număra celulele, 10 pl din suspensia celulară au fost amestecate cu 10 pl de albastru de tripan (factor de diluție: 2), iar celulele vitale (nestinse) au fost numărate într-o cameră de numărare Neubauer (Fig. 10). Vopseaua trypan albastru pătrunde în membranele celulare deteriorate și, prin urmare, marchează celulele non-vitale. O a doua porțiune de 10 pl din suspensia celulară a fost amestecată cu soluția Turk și adăugată în camera de numărare Neubauer pentru a determina numărul de celule albe din sânge. Acidul acetic conținut în soluția Türks lizează eritrocitele astfel încât să fie colorate în albastru. Fig. 10: Camera de numărare Neubauer. A: Reprezentarea schematică a unui hemocitometru în secțiune transversală. B: Reprezentare schematică a zonei de numărare. Cadrantele care trebuie numărate sunt conturate în roșu (Woermann, 2000). Pentru a calcula PBMC-urile vitale, trebuie luat în considerare volumul de lichid din camera de numărare și diluarea celulelor în soluțiile de colorare. Zona
MATERIALE ȘI METODE 29 Pentru a găsi nivelul de expresie a mirna dintre grupurile de control și tratament, s-a utilizat testul t Student independent, cu două fețe. Valorile P calculate au fost corectate cu rata de descoperire falsă (FDR) pentru teste repetate (Benjamini și Hochberg, 1995). Mirne dereglate cu o valoare P corectată de 20%, un diametru al tumorii> 15 mm și dezvoltarea necrozei țesuturilor. Dacă nu se descrie altfel, intervențiile au avut loc sub anestezie intraperitoneală cu ketamină-xilazină (ketamină: 75 mg/kg, Ketanest, Pharmacia GmbH, Erlangen, Germania; xilazină: 15 mg/kg, Rompun, Bayer, Leverkusen, Germania). După finalizarea experimentelor, animalele au primit o supradoză de pentobarbital (200
Materiale și metode 46 Fig. 18: Microscopie fluorescentă intravitală. Configurarea microscopului de fluorescență (FM) cu lampă cu vapori de mercur (HBO), lentile de distanță lungă (LDO) și sistem de documentare video cu cameră video (VK) și DVD recorder (DVD). Datele au fost evaluate offline folosind software-ul CapImage (Zeintl, Heidelberg, Germania). Analizele au inclus măsurarea dimensiunii tumorii [mm 2] și a densității capilare funcționale [cm/cm 2]. Aceasta este definită ca lungimea totală a vaselor perfuzate pe câmp vizual. În această lucrare a fost analizată densitatea capilară funcțională a sferoidului tumoral complet. 3.10. Modelul tumorii Flank Generarea tumorilor flancului și măsurătorile cu ultrasunete au fost făcute cu sprijinul amabil al Jeannette Rudzitis-Auth, Institutul de Chirurgie Clinico-Experimentală, Universitatea Saarland. 3.10.1. Generarea tumorilor flancului Pentru a genera tumorile flancului, șoarecii masculi C57BL/6 au fost anesteziați scurt cu un amestec de 4% izofluran și oxigen. Fiecare șoarece a fost injectat subcutanat cu 1 × 105 celule de melanom B78H1 pe flanc într-un volum de 50 μl PBS.
Se aplică materialul și metodele 50. În analizele post hoc, eroarea alfa a fost ajustată în funcție de Bonferroni pentru a corecta măsurătorile repetate. O valoare de P