ARN-urile mici necodificatoare din regulonul sistemului CiaRH cu două componente în Streptococcus

Micii ARN necodificatori din regulonul sistemului CiaRH cu două componente în Streptococcus pneumoniae Disertație de Dipl.-Biol. Aprobată de Departamentul de Biologie de la Universitatea Tehnică din Kaiserslautern pentru acordarea diplomei universitare Doctor în Științe ale naturii. Márta Kovács Președinte al comitetului de doctorat: Prof. Dr. Matthias Hahn Reporter 1: Prof. Dr. Regine Hakenbeck Reporter 2: Prof. Dr. John A. Cullum Data discuției științifice: 8 mai 2009 Kaiserslautern

Lucrarea de față a fost efectuată în departamentul de microbiologie al Departamentului de Biologie de la Universitatea Tehnică din Kaiserslautern sub conducerea prof. Dr. Regine Hakenbeck a făcut.

Prin prezenta confirm, Márta Kovács, că am pregătit eu însuși lucrarea de față. Vă asigur că am folosit doar sursele și resursele indicate. Kaiserslautern, 17 martie 2009

Cuprins Cuprins Cuprins Cuprins 1 Rezumat 5 Abrevieri 7 1. Introducere 8 1.1 Streptococcus pneumoniae 8 1.2 Competența genetică și liza Streptococcus pneumoniae 10 1.3 Sistemul cu două componente CiaRH 13 1.4 ARN-uri mici necodificate 16 1.5 Scopul acestei lucrări 22 2. Material 23 2.1 Tulpini bacteriene 23 2.2 Plasmide 25 2.3 Oligonucleotide 26 2.4 Mediu nutritiv 31 2.4.1 Mediul CpH8 31 2.4.2 Mediul THB 32 2.4.3 Agar de sânge D 32 2.4.4 Mediul LB 33 2.4.5 Mediul 2xTY 33 2.5 Antibiotice utilizate 34 3. Metode 35 3.1 Metode microbiologice 35 3.1.1 Documentarea creșterii bacteriene 35 3.1.2 Condiții de cultivare 35 3.1.3 Conservarea tulpinii 36 3.1.4 Microscopie 36 3.1.5 Transformarea Streptococcus pneumoniae 36 3.1.6 Testarea competenței Streptococcus . pneumoniae 37 3.1.7 Transformarea Escherichia coli 37 1

Cuprins 4.10 Investigația efectului csrna individuale asupra traducerii comc 144 5. Discuție 146 5.1 Promotorii intergenici reglementați de CiaRH și transcrierile acestora: 146 Csrnas 5.2 Strategii pentru găsirea genelor țintă csrna 148 5.3 Validarea genelor țintă csrna in vivo 150 5.4 Interacțiune a csrnas cu mrnas ale genelor lor țintă 153 5.5 Relația dintre fenotipurile asociate CiaRH 156 și csrnas 5.6 Efecte și mecanisme similare în alte organisme 163 5.7 Outlook 165 6. Bibliografie 167 4

1. Introducerea pare a fi implicată în reglarea adezinelor extracelulare și a factorilor de virulență secretați (Kreikemeyer și colab., 2001). Un alt ARN de reglare este pelusul. Acest locus a fost descoperit prin analiza unei biblioteci de transpozoni și s-a remarcat pentru efectul său pleiotrop asupra expresiei exoproteinelor. Gena pentru ARN are o lungime de 459 bp, cu o altă genă, saga, fiind codificată între pozițiile 147 - 308 bp. Cu toate acestea, s-ar putea arăta că ARN netradus și nu produsul tradus SagA influențează expresia factorilor de virulență (Mangold și colab., 2004). Al treilea ARN mic cunoscut este RivX. Acest ARN pare a fi un produs de prelucrare a transcriptului rivrx. Deși există și un ORF pe transcriere aici, s-ar putea arăta că ARN-ul și nu proteina au efect de reglare asupra genelor reglementate. Acest ARN declanșează un efect pozitiv asupra genelor reglate de Mga, care este un important regulator al virulenței (Roberts și Scott, 2007). 21

2. Material 2.4 Medii de cultură 2.4.1 Mediu CpH8 (mediu C) pentru cultura Streptococcus pneumoniae În toate investigațiile efectuate în această lucrare, tulpinile Streptococcus pneumoniae au fost cultivate în mediu CpH8 (Lacks & Hotchkiss, 1960). Componentele individuale ale acestui mediu au fost produse separat și pipetate împreună doar atunci când este necesar. Componentele individuale au fost depozitate la 4 ° C. cu excluderea luminii. Tabelul 2.17: Compoziția mediului CpH8 Cantitatea componentului [ml] Supliment PreC 400 13 Glutamină [1 mg/ml] 10 Adams III 10 Piruvat 2% 5 Tampon fosfat 15 Extract de drojdie 5% 9 Volumul final 462 Tabelul 2.18: Compoziția componentelor individuale Componentă Cantitate suplimentară PreC Acetat de Na, anhidru 1,2 g casaminoacizi 5 g L-triptofan 5 mg L-cisteină 50 mg H2O și 1000 ml supliment ajustează pH 7,5, autoclavă 3 în 1 săruri 60 ml glucoză 20% (g/v) 120 ml zaharoză 50% (g/v) 6 ml adenozină [2 mg/ml] 120 ml uridină [2 mg/ml] 120 ml componente autoclave individual, pipetați împreună în condiții sterile Adams III Adams I 160 ml Adams II 40 ml asparagină 2 g clorură de colină 0, 2 g CaCl 2 [0,1 M] 1,6 ml H 2 O și 1000 ml filtrare sterilă și se păstrează sub excludere ușoară Tampon fosfat ph8 KH 2 PO 4 [1 M] 53 ml K 2 HPO 4 [1 M] 947 ml autoclavare 31

2. Material săruri 3in1 Adams I Adams II MgCl 2 x6h 2 O 100 g CaCl 2, anhidru 0,5 g MnSO 4 x4h 2 O [0,1 M] 0,2 ml H 2 O și 1000 ml autoclavare Biotină 0, 5 g acid nicotinic 150 mg piridoxină HCl 175 mg pantotenat de calciu 600 mg tiamină HCl 160 mg riboflavină 70 mg H 2 O și 1000 ml filtru steril și se păstrează sub lumina FeSO 4 x7h 2 O 500 mg CuSO 4 x5h 2 O 500 mg ZnSO 4 x7h 2 O 500 mg MnCl 2 x4h 2 O 200 mg HCI conc. H 2 O 10 ml și 1000 ml filtrare sterilă și depozitare cu excluderea luminii 2.4.2 Mediu Todd-Hewitt (THB) Mediul Todd-Hewitt este un mediu complex care este adesea utilizat pentru pneumococi și a fost obținut gata de utilizare (Difco, Detroit, SUA). Mediul a fost preparat și autoclavizat conform instrucțiunilor producătorului. Tabelul 2.19: Compoziția mediului Todd-Hewitt Componentă Cantitatea de inimă bovină (infuzie de țesut proaspăt) 3,1 g peptonă 20 g glucoză 2 g NaCI 2 g carbonat de sodiu 2,5 g fosfat disodic 0,4 g 2,4,3 D agar de sânge Ca mediu solid pentru Cultura Streptococcus pneumoniae a fost folosită D agar de sânge. În acest scop, agar-D a fost autoclavizat și, după răcire la 48 ° C, s-a adăugat sânge de oaie (Oxoid) defibrinat la o concentrație finală de 3% (v/v). După adăugarea oricăror aditivi, cum ar fi antibioticele, amestecul a fost amestecat și turnat în cutii Petri sterile. 32

2. Materiale Tabelul 2.20: Compoziția componentului agar D din sânge glucoză bactopeptonă extract de drojdie neopeptonă NaCl Tris agar H 2 O cantitate 1 g 10 g 5 g 1,25 g 5 g 1,25 g 15 g la 1000 ml 2,4,4 LB mediu Mediul Lauria-Bertani (LB) a fost utilizat pentru cultura E. coli (Sambrook și colab., 1989). Pentru a produce agar LB, s-au adăugat 15 g/l agar la mediu. Au fost adăugați antibiotice și alți aditivi corespunzători, după cum este necesar. Tabelul 2.21: Compoziția mediului LB Componentă Cantitate bactopeptonă 10 g NaCI 5 g extract de drojdie 5 g H2O la 1000 ml 2.4,5 mediu 2xTY Mediul 2xTY a fost utilizat pentru a izola cantități mai mici de plasmidă din E. coli. Tabelul 2.22: Compoziția mediului TY Cantitate componentă Bactopeptonă 16 g NaCI 5 g extract de drojdie 5 g H2O la 1000 ml 33

2. Material 2.5 Antibiotice utilizate Antibioticele rezumate în Tabelul 2.23 au fost adăugate la mediul solid și lichid, după cum este necesar. După prepararea lor, soluțiile stoc au fost filtrate steril și depozitate la -20 ° C. Tabelul 2.23: Antibiotice utilizate Solvent antibiotic Concentrația soluției mamă Tetraciclină 50% EtOH 3 mg/ml 3 µg/ml Concentrație finală Ampicilină H 2 O 20 mg/ml 100 µg/ml Spectinomicină H 2 O 20 mg/ml 80 µg/ml Streptomicină H 2 O 20 mg/ml 200 µg/ml Eritromicină 90% EtOH 1 mg/ml 1 µg/ml Kanamicină H 2 O 20 mg/ml 200 µg/ml Cloramfenicol H 2 O 1 mg/ml 1 µg/ml 34

4. Rezultate 1.0 Eficiența transformării% 0,8 0,6 0,4 0,2 R6 RK12345 RK123 RK45 R6 ciar: aad9 0,0 0 20 40 60 80 100 120 Densitatea celulei [NU] Figura 4.24: Eficiența transformării diferitelor ccn tulpini de deleție comparativ cu tipul sălbatic S. pneumoniae R6 și S. pneumoniae R6 ciar: aad9. Densitatea celulei în unități nephelo este afișată pe axa X. Eficiența transformării în procente (proporția de celule transformate în numărul de germeni vii) este pe axa Y. Tipul sălbatic R6 este negru, RK12345 este roșu, RK123 este verde, RK45 este albastru închis și S. pneumoniae R6 ciar: aad9 este afișat în albastru deschis. Rezultatele investigației transformabilității naturale a tulpinilor RK12345, RK123 și RK45 indică o legătură între ARN-urile mici care nu codifică și transformabilitatea naturală a S. pneumoniae R6. Toate cele trei tulpini examinate au prezentat o transformabilitate redusă. Acest fenotip nu a putut fi observat cu R6 ciar: aad9. A fost posibil doar să se determine o schimbare a vârfului competenței în direcția densităților celulare mai mici. Scăderea de opt ori a transformabilității tulpinii RK12345 contrazice transformabilitatea completă a tulpinei cu ciar șters. 105

4. Rezultate 4.7.3 Determinarea activității ß-galactozidazei a genei țintă - proteine de fuziune LacZ în funcție de csrnas Activitatea proteinelor de fuziune genă - lacz țintă în funcție de csrnas a fost determinată prin teste de ß-galactozidază. În acest scop, plasmidele au fost inserate în genomul S. pneumoniae R6 de tip sălbatic și mutantul csrna S. pneumoniae RK12345. Activitatea β-galactozidazei a fost măsurată folosind lizatele cu celule întregi ale tulpinilor respective. Măsurătorile au fost efectuate în faza exponențială medie la o densitate celulară de Nephelo 80 și la scurt timp după intrarea în faza staționară. Rezultatele măsurătorilor sunt prezentate în Figura 4.30. R6 RK12345 20 T3comA 50 40 T3hsdS Unități ß-Gal 15 10 5 Unități ß-Gal 30 20 10 0 0 exp. Faza stat. Exp. Fază Faza stat. Unități de fază ß-Gal 80 60 40 20 T3spr1610 Unități ß-Gal 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 T3comC 1000 0 exp. Faza stat. Exp. Faza 0 Faza stat. Faza 800 700 600 T3spr0081 8000 7000 6000 T3cibB Unități ß-Gal 500 400 300 Unități ß-Gal 5000 4000 3000 200 2000 100 1000 0 exp. Faza stat. Exp. Faza 0 Faza stat. Faza 125

4. Rezultate 700 600 T3spr0231 200 180 160 T3blpY Unități ß-Gal 500 400 300 200 100 Unități ß-Gal 140 120 100 80 60 40 20 0 exp. Faza stat. Exp. Faza 0 Faza stat. Fază Unități ß-Gal 400 350 300 250 200 150 T3spr0822 Unități ß-Gal 50 40 30 20 T3spr1932 100 50 10 0 0 exp. Faza stat. Exp. Fază Faza stat. Faza 20 T3spr0265 80 T3spr1645 15 60 Unități ß-Gal 10 Unități ß-Gal 40 5 20 0 exp. Faza stat. Exp. Faza 0 Faza stat. Faza 1000 800 PvegT ß-Gal Unități 600 400 R6 RK12345 200 0 exp. Faza stat. Faza Figura 4.30: Activități β-galactozidază ale celor 12 gene țintă clonate - proteine de fuziune lacz în S. pneumoniae R6 de tip sălbatic și în S. pneumoniae RK12345. Măsurătorile au fost efectuate în două momente: în faza exponențială la o densitate celulară de Nephelo 80 și la scurt timp după intrarea în faza staționară. Unitățile sunt definite ca proteine ONP/min/mg eliberate de nmol. Sunt prezentate mijloacele a cel puțin 2 experimente independente. Activitățile proteinelor de fuziune genă-lacz țintă în mediu C sunt prezentate în negru pentru S. pneumoniae R6 și roșu pentru S. pneumoniae RK12345. Ca martor, activitatea promotorului P vegt a fost determinată în ambele tulpini. 126

4. Rezultate Figura 4.39: Analize Bandshift și analiza Northern blot a complexelor de interacțiune ale comc-rna și csrna3. Imaginile de mai sus arată gelurile de schimbare în bandă colorate cu SYBRGreenII. Încărcarea gelului este așa cum s-a descris anterior. Benzile de interacțiune sunt marcate cu săgeți roșii. Imaginile de mai jos prezintă gelurile șterse. În imaginea din stânga, a fost utilizată o sondă specifică pentru csrna3 pentru detectare. În imaginea din dreapta, membrana a fost tăiată și comcbzw. sonde htra-specifice utilizate. Benzile de interacțiune șterse sunt marcate cu săgeți roșii. Test de interacțiune cu spr0081 Testele de interacțiune au fost efectuate cu toate cele 5 csrnas. Benzile de interacțiune clare ar putea fi detectate în csrna2, csrna3, csrna4 și csrna5. În același timp, dispariția spr0081-rna la înălțimea sa reală de mers a putut fi observată în aceste piste. În csrna1 nu s-au putut vedea benzi de interacțiune clare și nici banda spr0081 nu s-a schimbat. Astfel spr0081-rna nu a format un complex de interacțiune cu csrna1. Și aici, csrna1 a format benzi la aproximativ două ori înălțimea (Figura 4.40, banda 5). Aceste benzi au fost văzute și în ultimele urme ale controlului negativ. 142

5. Discuție 5. Discuție 5.1 Promotorii intergenici reglementați de CiaRH și transcrierile acestora: csrnas Promotorii intergenici reglementați de CiaRH sunt puternic dependenți de CiaR. Fără un regulator de răspuns funcțional, practic nu există expresie (Halfmann și colab., 2007). Activitățile acestor promotori sunt prezentate în Tabelul 5.1. Tabelul 5.1: Activitățile β-galactozidazei rezultate din promotorii intergenici reglementați de CiaRH Promotori R6 ciar: aad9 R6 (wt) R6 ciaht230p P ccnc