Clonarea
Ce zici de o clonă a ta? Cineva care se ridică dimineața și merge la școală pentru tine, îți face temele și ordonează camera, astfel încât să ai suficient timp pentru cinema? O idee grozavă sau poate nu?
4. Instrumentele clonării genelor
Cercetătorii folosesc diverse instrumente moleculare pentru clonare. Enzimele de restricție (mai precis endonucleaze de restricție), care pot recunoaște și tăia ADN-ul în anumite poziții, sunt esențiale. Enzimele de restricție se găsesc în bacterii și pot fi comparate cu câinii de pază: protejează bacteriile de pătrunderea virusurilor. Enzimele de restricție recunosc ADN-ul viral și îl separă într-un proces numit restricție. Enzimele de restricție pot face diferența între ADN-ul propriu și ADN-ul străin, deoarece ADN-ul dvs. propriu este marcat chimic de un grup metil, care funcționează ca un steag. Cu toate acestea, ADN-ul străin nu poartă acest steag.
Enzimele de restricție funcționează extrem de specific: recunosc secvențe scurte de ADN și taie firul ADN în acest moment. O enzimă de restricție folosită adesea de cercetători în experimente se numește Eco RI, prima enzimă de restricție descoperită în bacteria Escherichia coli (E. coli). Recunoaște și taie secvența GAATTC, lăsând în urmă așa-numitele capete lipicioase (vezi secvența de film „Tehnologia ADN-ului recombinant”). Piesele de ADN (fragmente) create în acest mod pot fi legate din nou relativ ușor între ele (vezi Figura 2.1).
În plus față de enzimele de restricție, plasmidele sunt un alt instrument pentru clonare. Plasmidele sunt „taxiuri genetice”: pot prelua ADN străin și îl pot transfera la bacterii. Bacterii, de ex. E. coli preia apoi producția de gene și proteine. Bacteriile E. coli sunt principalele organisme testate în multe laboratoare și sunt cele mai bine cercetate viețuitoare.
Pentru ca clonarea să funcționeze, cercetătorii folosesc un truc: plasmidele utilizate au, de asemenea, o genă care dă bacteriilor care ingerează rezistența plasmidei la antibioticul ampicilină. Această rezistență se va dovedi importantă mai târziu.
În experimentul nostru, enzima de restricție Eco RI taie ADN-ul uman pe care l-am obținut din proba de salivă. Acest lucru creează mii de bucăți de ADN - dintre care una conține gena insulinei pe care o căutăm. Folosim aceleași enzime pentru a tăia plasmidele bacteriene. Datorită capetelor lipicioase, putem pune bucățile individuale la loc. Multe plasmide nu vor prelua nimic, multe vor prelua ADN uman și câteva vor prelua gena insulinei pe care o caută. Toate plasmidele sunt apoi introduse în bacteriile E. coli.
Acum distribuim toate bacteriile pe o placă cu un mediu nutritiv, pe care bacteriile în principiu nu pot crește deoarece placa conține antibioticul ampicilină. Cu acest pas, grâul este separat de pleavă: toate bacteriile care au ingerat o plasmidă pot crește pe placă și pot forma o colonie, deoarece plasmida le face rezistente la ampicilină. Bacteriile se înmulțesc și cu ele gena de insulină dorită.
În acest moment, am clonat mii de bucăți de ADN uman și nu doar cele care ne interesează. Următorul pas, screeningul tuturor coloniilor, consumă mult timp.
Cum îl putem găsi pe cel care ne poartă gena insulinei din toate miile de clone? Dacă cunoaștem deja o parte din secvența ADN a genei insulinei, atunci putem produce o bucată de ARNm lung de aproximativ 30 de perechi de baze, care va atrage pe secvența genei insulinei ca o sondă. Această sondă este radioactivă sau etichetată cu fluorescență, astfel încât să putem determina cu ce clone se ancorează. Datorită acestei sonde, găsim clona care conține gena insulinei noastre (vezi Figura 2.2). Multe alte gene pot fi clonate folosind această tehnică, de ex. pentru hormoni de creștere și interferon, produse genetice care sunt, de asemenea, utilizate ca medicamente.
Clonarea genelor este acum finalizată cu succes și devine clar de ce sunt utilizate bacteriile pentru acest lucru și nu pentru organismele superioare: organismele superioare se reproduc sexual. Pentru aceste ființe vii, sexualitatea are avantajul că structura genetică este recombinată și că din ea ies noi indivizi cu caracteristici noi. Acest lucru creează avantaje în evoluție. Cu toate acestea, pentru cercetători, această nouă combinație genetică este perturbatoare, deoarece ar putea schimba și gena insulinei.
Cercetătorii trebuie să lucreze cu animale identice din punct de vedere genetic: doar clonele reacționează întotdeauna în același mod într-un experiment. Când cercetătorii doresc să testeze un medicament, ei folosesc întotdeauna șoareci din aceeași tulpină. Astfel de tulpini de șoarece sunt crescute cu ajutorul consangvinizării sau animale strâns legate sunt încrucișate între ele.