Detectarea genomului metapneumovirusului uman (hmpv) la copii spitalizați - PDF gratuit

Detectarea genomului metapneumovirusului uman (hmpv) la copii spitalizați Disertație inaugurală pentru obținerea titlului de doctor al Facultății de Medicină Superioară din Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Thomas Bernd Glatzel din Bonn 2008

Pregătit cu aprobarea Facultății de Medicină a Universității din Bonn 1. Recenzant: Dipl.-Biol. Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Oliver Schildgen Recenzor 2: Prof. Dr. med. Ziua examinării orale Jürgen Rockstroh: 27 octombrie 2008 De la Institutul Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn pentru Microbiologie Medicală, Imunologie și Parazitologie Director: Prof. Dr. med. Publicație Achim Hörauf: Această disertație este publicată electronic pe serverul de publicații al universității ULB http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online.

Cuprins 0 Lista prescurtărilor 7 1 Introducere 9 1.1 Paramixovirusuri 9 1.1.1 Clasificare 10 1.1.2 Structură 12 1.1.2.1 Particule de virus 12 1.1.2.2 Genom și structura genomului 12 1.1.2.3 Proteine virale 14 1.1.3 Replicare 16 1.1.4 Virusuri parainfluențiale 17 1.1.5 Virusul oreionului 19 1.1.6 Virusul rujeolei 20 1.1.7 Virusul sincițial respirator (RSV) 23 1.1.8 Metapneumovirus uman (hmpv) 25 1.2 Obiectivul lucrării 29 2 Material și metode 30 2.1 Material 30 2.1.1 Echipament 30 2.1.2 Produse chimice 31 2.1 .3 Mediu 32 2.1.4 Culturi celulare 33 2.1.5 Soluții stoc 33 2.1.6 Tampoane 34 2.1.7 Teste rapide 34 2.1.8 Sisteme reactive 35 2.1.9 Enzime 35 2.1.10 Nucleotide 35 2.1.11 Grunduri 35 2.1.12 Standard de dimensiune ADN 36 5

2.1.13 Plasmide 36 2.1.14 Eșantioane 36 2.2 Metode 37 2.2.1 Cultură celulară 37 2.2.2 Extracția ARN din supernatantul culturii celulare utilizând kitul RNeasy Protect Mini 38 2.2.3 Reacție în lanț polimerazică (PCR) 40 2.2.4 Electroforeză pe gel 45 2.2.5 Purificare PCR se amplifică utilizând kitul de purificare QIAquick-PCR 46 2.2.6 Clonarea PCR se amplifică utilizând kitul de clonare TOPO TA 47 2.2.7 Secvențierea plasmidelor recombinate 50 3 Rezultate 52 3.1 Tampon ARN-ulterior 52 3.2 Cultura celulelor 53 3.3 Optimizarea PCR 53 3.4 infecții hmpv și RSV 54 3,5 Distribuția vârstei 55 3,6 Curs sezonier 56 3,7 Simptome și diagnostic 57 3,8 Coinfectii 57 3,9 Cazuri 58 3,10 Hmpv și otită medie 65 4 Discuție 67 5 Rezumat 71 6 Bibliografie 72 7 Mulțumiri 88 6

0 Lista abrevierilor: APV Pneumovirus aviar CMV CPE CRP CT Citomegalie Virus Efect citopatic Proteină C reactivă Tomogramă computerizată ADN dntps Acid dezoxiribonucleic Deoxiribonucleozid trifosfați E. coli Escherichia coli EDTA Etilendiamină acid tetraacetic EEG Enzimă și alte seruri de vițel fetal FCS GCS Glasgow coma scale HBV HCV HHV hmpv HSV Virusul hepatitei B Virusul hepatitei C Virusul herpesului uman Virusul metapneumovirusului virusul herpesului simplex kb kd Kilobazele Kilodalton 7

LB mm mrna MRT Luria-Bertani Acid mesenger-ribonucleic milimolar Tomogramă cu rezonanță magnetică ND nm NS neefectuată Nanometru Proteină nestructurală PBS PCR Fosfat tamponat salină Reacție în lanț polimerază SDS SSPE Sodiu dodecil sulfat Scleroză subacută Panencefalita ARN rpm Riscular UV

Paramixovirusurile se caracterizează prin următoarele cinci proprietăți: 1. Au un ARN monocatenar orientat negativ, care se găsește exclusiv într-o nucleocapsidă elicoidală rezistentă la ARN, care conține și polimeraza virală. 2. Transcrierea se efectuează în modul tipic stop-repornire. 3. Replicarea virală are loc în citoplasmă. 4. Particulele virusului necesită un înveliș lipidic pe celulele țintă pentru a se lega acolo. 5. Virusul pătrunde în celulă prin fuziunea membranei virusului cu membrana celulară (Collins și colab., 2001) 1.1.1 Clasificare Paramixovirusurile sunt clasificate în două subfamilii: paramixo- și pneumovirinae. Divizarea ulterioară în genuri și unii reprezentanți caracteristici este prezentată în Tabelul 1. 10

Subfamilie genul animal uman Paramyxovirinae Respirovirus Parainfluenzavirus tipurile 1 și 3 virusul parainfluenza bovin tip 3, virusul Sendaivirus Rubulavirus Mumps, virusul parainfluenza tip 2 și 4a, b virusul parainfluenza canin tip 2, virusul virusului virusului virusului parainfluenței, virusul virusului virusului Newcastle -Petite- Ruminante-Virus Henipavirus Hendravirus Nipahvirus Hendra Nipah Menangle Pneumovirinae Pneumovirus Respirator Bovin Syncytial Virus (RS- Respiratory Virus) Syncytialvirus, Pneumoniavirus al șoarecelui Metapneumovirus Virus Rinotraheită Virus Rinoterapie umană de către Comitetul internațional de taxonomie a virusului în 2000 11

2 Material și metode 2.1 Material 2.1.1 Echipament pentru incubator: incubator cu gaz CO 2, Heraeus, incubator Hanau C200, Labotect, camere de electroforeză Meckenheim: Model B1, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Model 41-1825, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Schüttler: Certomat S, Sartorius BBI Systems International GmbH Platformă basculantă, Biometra GmbH, Göttingen Sequencer: 3130 Analizator genetic, Biosisteme aplicate, Darmstadt Dispozitive de tensiune: Alimentare Model 500/200, Laboratoare Bio-Rad, Alimentare München Model 250/2.5, Laboratoare Bio-Rad, Bănci sterile din München: Herasafe, Heraeus Instruments, Hanau STERIL-ANTARES, Biohit Deutschland GmbH, Rosbach Thermocycler: Mastercycler gradient, Eppendorf, Hamburg T3 Thermocycler, Biometra GmbH, Göttingen Vortexer: Vortex-Genie2, Fisher: PM 1200, Mettler Toldedo GmbH, Elveția Baie de apă: GFL 1038, Gesellschaft für Labortechnik mbh, Burgwedel Centrifuge: Biofuge 13, Heraeus Instruments, Hanau Cent carabină 5415 C/5417 C, Eppendorf AG, Hamburg Megafuge 1.0, Heraeus Instruments, Hanau MULTIFUGE L-R, Heraeus Instruments, Hanau TDX Centrifuge TM, Abbott Diagnostica, Wiesbaden UJ II KS, Heraeus Instruments, Hanau 30

2.1.2 Companii chimice ale căror substanțe chimice au fost folosite sunt: Agaroză Ampuwa Bacto-Agar Bacto-triptonă Bacto Extract de drojdie Acid boric Bromofenol Blue Eagle s-minimal Esențial EDTA Etanol Bromură de etidiu Ser de vițel clorură de potasiu Fosfat de potasiu Clorură de sodiu clorură de sodiu fosfat de sodiu Soluție de tripsină/EDTA SeaPlaque GTG Agarose, Cambrex Bio Science Rockland, Inc; Biozym Seakem LE Agarose, Biozym, Oldendorf NuSieve GTG Agarose, Biozym, Oldendorf Fresenius Kabi, Bad Homburg Difco, Detroit, SUA Difco, Detroit, SUA Difco, Detroit, SUA Merck KGaA, Darmstadt Serva, Heidelberg Biochrom AG, Berlin Merck KGaA D KGaA Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Biochrom, Berlin Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Biochrom AG, Berlin 31

2.1.3 Media Eagle s Minimal Essential Medium Eagle s-mem-earle NaHCO 3 Adăugare de: Glutamină Penicilină G Streptomicină Ser fetal de vițel Biochrom AG, Berlin 2,2 g/l 280 µg/l 40 U/ml 50 µg/l 10% (v/v) mediu Luria Bertani (mediu LB) cu extract de drojdie de ampicilină Bacto 2,5 g Bacto-triptonă 5 g NaCl 2,5 g Aqua dest. ad 500 ml Acest amestec a fost autoclavizat timp de 20 de minute, depozitat la frigider la 4 ° C și s-au adăugat 50 μg ampicilină înainte de inoculare. Plăci de agar Luria Bertani (plăci de agar LB) cu ampicilină Extract de drojdie Bacto 2,5 g Bacto triptonă 5 g NaCl 2,5 g Bacto agar 6,25 g apă distilată. ad 500 ml Acest amestec a fost autoclavizat timp de 20 de minute, după ce mediul s-a răcit, s-au adăugat 50 µg ampicilină și câte 20-30 ml au fost puse într-o cutie Petri (Ø: 10 cm) și aceasta a fost apoi păstrată la 4 C în frigider. 32

Mediu SOC (6 ml) triptonă 2% extract de drojdie 0,5% NaCl 10 mm KCl 2,5 mm MgCl 2 10 mm MgSO 4 10 mm glucoză 20 mm 2.1.4 Culturi celulare Celule Vero-B4 ATCC-ACC-33 LLC -Celule MK2 ATCC-CCL7 celule MS care nu sunt listate cu ATCC celule MDCK ATCC-CLL-34 celule RD A-204; ATCC-ACC-250 2.1.5 Soluții stoc Ampicilină 50 mg/ml (H2O) EDTA (0,5M) EDTA Aqua dest. titrat la pH 8 cu NaOH, autoclavizat 186,1 g și 1000 ml bromură de etidiu 10 mg/ml 33

Soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Aqua dest. pH titrat la 7,4 cu HCI, autoclavizat 8 g 0,2 g 1,44 g 0,24 g ad 1000 ml 2.1,6 Tampon tampon Tris-borat-EDTA (tampon TBE 5x) acid boric tris-bazic EDTA ( 0,5 M) H 2 O 54 g 27,5 g 20 ml ad 1000 ml 2.1.7 Teste rapide Test rapid RSV Test rapid gripal Test test RSV, Directigen, Sparks SUA Kit grip A + B, Directigen, Sparks SUA Folosind aceste teste rapide fiecare probă primită de la pacienții cu infecții ale tractului respirator superior și inferior a fost testată pentru gripă și RSV. Rezultatele acestor teste au fost încorporate în secțiunea de rezultate a acestei lucrări. 34

8 sisteme reactive BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems, Foster City SUA Extinde sistemul de înaltă fidelitate PCR Roche Diagnostics GmbH, Mannheim HiSpeed Midi Qiagen GmbH, Hilden, HiSpeed Maxi Qiagen GmbH, Hilden, Germania One Step RT-PCR Kit Qiagen GmbH, Hilden, Germania QIAprep Spin Miniprep Qiagen GmbH, Hilden, Germania QIAquick-PCR-Kit de purificare Qiagen GmbH, Hilden, Germania RNeasy Protect Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden, Germania Topo-TA Cloning Kit Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany 2.1.9 Enzime de restricție enzimatică EcoR1 Biolabs, Schwalbach, Germania ADN polimerază Thermus aquaticus ADN polimerază Roche Applied Science, Mannheim, Germania Thermus aquaticus ADN polimerază Qiagen GmbH, Hilden, Germania Reverse transcriptase Omniscript, Sensiskript Reverse transcriptază Qiagen GmbH, Hilden, Germania 2.1.10 Nucleotide deoxiadenozină trifosfat ( 25 nm) deoxitimidin trifosfat (25 nm) deoxicitosină trifosfat (25 nm) deoxiguanozină fosfat (25 nm) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania 2.1.11 Grunduri Cele patru grunduri s-au bazat pe o publicație a Viazov și colab. (2003) luate. Prin urmare, secvențele lor corespund unei regiuni a genei N. 35

Toate grundurile utilizate pentru această lucrare au fost fabricate de Sigma, Deisenhoven. Secvențele care urmează acum sunt notate în direcția 5 3. 111s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGAG 705as TGCTTTGCTGCCTGTAGATGATGAG 114s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGAGGGG 442as GCCATTGTTTTYCTTGCYTC 2.1.12 Lungime ADN standard 1Kb Plus DNA-Marker, Mannheim al Spitalului Universitar de Copii Bonn din 1 octombrie 2001 până la 31 martie 2004 1 octombrie 2001 30 septembrie 2002 n = 5 (neincluse în studiu) 1 octombrie 2002 31 martie 2003 n = 300 1 octombrie 2003 31 martie 2004 n = 332 n total = 632 36

Secvența țintă 1. Separarea catenelor prin încălzire la 95 C 2. Hibridizarea cu primerii prin răcire la 54 C 3. Sinteza ADN-ului prin extinderea primerilor la 72 C Figura 2 Ciclul PCR Pentru a multiplica secvența țintă - aici colorată în albastru - ADN-ul este Helixul dublu s-a topit în cele două fire simple prin încălzire la 95 ° C. Pentru a putea iniția o sinteză a ADN-ului, primerii complementari cu secvența țintă trebuie mai întâi să se atașeze. Acest lucru are loc atunci când amestecul de reacție este răcit la 54 C. Apoi, pornind de la primerii, ADN polimeraza sintetizează firele complementare la firele unice ale ADN-ului inițial. Această etapă de reacție are loc la 72 C. Aceste etape sunt repetate de mai multe ori și cantitatea de ADN crește exponențial. 41

PCR imbricat Un PCR imbricat urmează un PCR clasic. După ce o secțiune mai mare de ADN care conține ADN-ul țintă a fost reprodusă, această secțiune este utilizată ca șablon pentru PCR imbricată, în care este reprodusă o secțiune mai mică care conține și ADN-ul țintă (vezi Fig. 3.2). Această procedură permite creșterea sensibilității și specificității PCR. În această lucrare, Sistemul PCR Expand High Fidelity Roche a fost utilizat pentru PCR imbricat. Primul prim rotund ADN țintă Primul prim rotund Primer rotund secund Primul transcript Primul secund rotund Amplicon specific ADN-ului țintă Figura 3 PCR imbricată Secțiunea superioară a figurii prezintă un PCR (vezi mai sus). A doua secțiune arată PCR-ul imbricat real. Primerii marcați cu primeri rotunzi secundari sunt cei ai PCR imbricat. Acestea sunt mai aproape de ADN-ul țintă decât primerii din prima rundă. Segmentele specifice de ADN sunt, de asemenea, amplificate aici folosind etape de reacție așa cum este descris mai sus pentru PCR. 42

52 C 30 sec recoacere 72 C 1 min alungire După aceste cicluri, alungirea terminală a fost efectuată la 72 C timp de 5 minute. După finalizarea acestui proces, loturile au fost depozitate la 4 ° C până la utilizarea ulterioară. Abordarea de reacție a PCR imbricat pentru hmpv Sistemul PCR Expand High Fidelity de la Roche, Mannheim a fost utilizat pentru PCR imbricat. Tampon de 10 ori PCR 5 µl dntps (100 mm) 3 µl amestec enzimatic 1 µl primer 114s (25 pmol/µl) 0,5 µl 442as primer (25 pmol/µl) 0,5 µl MgCl 2 (25 mm) 1 µl Apă fără ARN 34 µl șablon 5 µl 50 µl protocol al PCR imbricat După denaturarea inițială la 94 ° C timp de 2 minute, următorul ciclu a fost efectuat de 40 de ori: 94 ° C 30 sec denaturare 53 ° 30 sec recoacere 72 ° 45 sec alungire A urmat un alt terminal Alungire la 72 ° C timp de 5 minute și depozitare atât în cicler, cât și în frigider la 4 ° C. Seria de diluare pentru a optimiza PCR imbricată cu adăugarea de magneziu Spre deosebire de cea de Viazov și colab. (2003) au propus protocolul PCR, magneziul a fost adăugat la PCR imbricat pentru stabilizare în această lucrare. 44

35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 30,40% 26,70% 28,60% 22% 18% 13. 70% 4,30% 3,60% 3,95% Sezonul 2002/2003 Sezonul 2003/2004 total hmpv RSV hmpv + rsv Tabelul 6 Ponderi procentuale ale RSV și hmpv sau infecții duble din perioadele 01.10.2002 până la 31.03. 2003 (sezonul 2002/2003), 1 octombrie 2003 - 31 martie 2004 (sezonul 2003/2004) și pentru întreaga perioadă (total), pe baza colectivului total de 300 sau 332 de pacienți din perioadele menționate. 3.5 Distribuția în funcție de vârstă Distribuția în funcție de vârstă a infecțiilor cu hmpv a determinat următoarea distribuție: nou-născuți (cu vârsta de 4 săptămâni) n = 0 (0%), 5 săptămâni-5 luni n = 16 (14,03%), 6-12 luni n = 20 ( 17,54%), 13-24 luni n = 21 (18,42%),> 24 luni n = 31 (27,19%). Mai mult de jumătate dintre pacienții infectați cu hmpv au fost, prin urmare, mai în vârstă de 12 luni și mai mult de o treime dintre pacienți au fost mai mari de 24 de luni. Vârsta a fost necunoscută la 26 de pacienți (22,8%). Distribuția în funcție de vârstă a datelor este prezentată în Tabelul 7. 55

22,80% 27,19% 0% 14,03% 18,42% 17,54% până la 4 săptămâni 5 săptămâni - 5 luni 6-12 luni 13-24 luni peste 24 de luni necunoscute Tabelul 7 Distribuția procentuală a vârstei pacienților cu hmpv -infecție în perioada 1 octombrie 2002 - 31 martie 2004. 3.6 Curs sezonier Imaginea prezentată în tabelul 8 a rezultat pentru distribuția sezonieră a infecțiilor cu hmpv. Nu există o acumulare sezonieră clară pentru începutul anului 2002/2003, în timp ce în sezonul 2003/2004 a existat un maxim clar în ianuarie. 30 25 20 15 10 5 0 hmpv 02/03 hmpv 03/04 octombrie noiembrie decembrie ianuarie februarie martie aprilie Tabelul 8 Tendința sezonieră a numărului de cazuri de hmpv în perioadele de iarnă 2002/2003 și 2003/2004 56

A Figura 9 B Imagine RMN axială ponderată T1 (A), FLAIR coronal (recuperare inversiune fluidă atenuată) (B) a unui pacient în vârstă de 14 luni cu dovezi de hmpv. Semnal semnificativ crește cortical și subcortical; interpretate ca leziuni în contextul encefalitei (Schildgen et al. 2005). Furnizat de Clinica Radiologică a Universității din Bonn. Figura 10 imagini CT ale aceluiași pacient la 2 zile după un RMN. Zonele hipodense; interpretat ca un semn al edemului cerebral general (pulpă și cortex). Acumularea hiperdensă în spațiul arahnoidian, care nu a fost încă văzută în RMN (Schildgen și colab. 2005). Furnizat de Clinica Radiologică a Universității din Bonn 61