Dezvoltarea unei analize multi-componente paralele a reacțiilor antigen-anticorp în
Dezvoltarea unei analize multicomponente paralele a reacțiilor antigen-anticorp în analiza doping Disertație pentru obținerea diplomei universitare „doctor rerum naturalium” (Dr. rer. Nat.) În disciplina științifică a biochimiei prezentată la Facultatea de Științe Matematice și Naturale a Universității din Potsdam de Kai Wunderlich Potsdam, 29 septembrie 2014
Această lucrare este licențiată în baza unui acord de licență Creative Commons: Atribuire Fără utilizare comercială Fără lucrare derivată 4.0 International Pentru a vizualiza termenii licenței, vă rugăm să urmați hyperlinkul: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ Online publicat pe serverul de publicații al Universității din Potsdam: URN urn: nbn: de: kobv: 517-opus4-76869 http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-76869
Viața este ca o bicicletă. Trebuie să mergi înainte pentru a nu-ți pierde echilibrul. Albert Einstein
Cuprins Lista tabelelor Lista figurilor V VII 1. Motivația 1 1.1. Dopajul într-un context social și sportiv. 1 1.2. Interziceri doping și necesitatea controalelor doping 5 1.3. Posibilități și perspective pentru testele la punctul de îngrijire în controalele antidoping. 7 2. Noțiuni de bază 9 2.1. Termenul de dopaj și clasificarea claselor de substanțe în lista WADA interzise. 9 2.2. Metode analitice pentru detectarea substanțelor dopante. 12 2.2.1. Cromatografia gazoasă/spectrometria de masă ca metodă analitică stabilită pentru analiza dopingului ... 13 2.2.2. Metode de detectare bazate pe imunoanalize pentru detectarea hormonilor peptidici și a factorilor de creștere 15 2.2.3. Cum funcționează anticorpii și rolul lor în imunoanalize. 16 2.3. Hormonii peptidici ca candidați la dezvoltarea unui test de dopare multiparameter. 19 2.3.1. Hormonul luteinizant (LH) și rolul său de agent dopant. 20 2.3.2. Gonadotropina corionică umană (hcg-i) și rolul său ca agent dopant. 23 2.3.3. Variante ale acestor hormoni peptidici și limite farmacologice. 24 2.4. Concept tehnic. 25 I.
4.3. Experimente de microarray pentru a determina reactivitatea încrucișată . 60 4.3.1. Microarray experimentează cu utilizarea simultană a diferiților anticorpi de detectare pe materialul de referință. 63 4.4. Determinați limita de cuantificare a hormonilor peptidici pe microarray. 67 4.4.1. Seria de concentrare a hcg-intact în 1 x tampon PBS 67 4.4.2. Seria de concentrare a hcg-β în 1 x tampon PBS. 68 4.4.3. Seria de concentrare a LH în 1 x tampon PBS. 69 4.5. Măsurarea probelor reale pe sticle și diapozitive din polimer 70 4.6. Efectuați o analiză a performanței pentru a determina D-SN și D-SP. 72 4.6.1. Determinarea sensibilității și specificității diagnostice a LH, hcg-intact și hcg-β. 72 4.7. Test de stabilitate la depozitare a microarrays în ceea ce privește rezultatele măsurătorilor. 77 4.7.1. Test de stabilitate la depozitare pe parcursul a douăsprezece săptămâni pentru detectarea hcg-intact. 77 4.7.2. Test de stabilitate la depozitare pe parcursul a douăsprezece săptămâni pentru detectarea hcg-β. 79 4.7.3. Test de stabilitate la depozitare pe parcursul a douăsprezece săptămâni pentru detectarea LH. 80 5. Discuție 83 6. Outlook 93 7. Rezumat 95 Bibliografie 99 A. Anexa 111 A.1. Tampoane și soluții. 111 A.1.1. Compoziție de gel SDS pentru separarea și colectarea gelului 113 A.2. Mese. 114 A.3. Publicații. 126 A.3.1. Publicații revizuite de colegi. 126
A.3.2. Prelegeri, precum și postere și publicații fără evaluare inter pares. 127 A.4. Relua. 128 A.5. Ziua Recunoștinței. 129 A.6. Declarația statutară. 130
Lista tabelelor 3.1.1 Dispozitive utilizate. 29 3.1.2 Consumabile utilizate. 30 3.1.3 Produse chimice și soluții utilizate. 31 3.1.4 Anticorpi. 32 3.1.5 Hormoni peptidici și material de probă. 33 3.1.6 Software utilizat. 34 3.2.1 Încărcare gel SDS-PAGE. 36 3.2.2 Configurarea testului Western blot. 37 3.2.3 Schema experimentală, reactivitate încrucișată pe microarray. 42 3.2.4 Clasificarea rezultatelor măsurătorilor folosind o matrice de adevăr 48 3.2.5 Dimensiunea eșantionului pentru a determina reproductibilitatea pe parcursul a douăsprezece săptămâni. 51 4.1.1.Test de reactivitate încrucișată a anticorpilor de captură monoclonali. 56 4.1.2.Test de reactivitate încrucișată a anticorpilor de detectare policlonali. 57 4.2.1.Compararea soluțiilor de spălare pe microarrays prelucrate. 60 4.3.1 Test de reactivitate încrucișată cu hcg-i pe microarrays de detectare și anticorpi secundari în 1 x PBS. 61 4.3.2 Determinarea efectelor matricei și a reactivităților încrucișate în eșantioane complexe. 65 4.5.1 Măsurarea probelor reale pe sticlă și diapozitive din polimer 71 4.6.1.Curbele ROC ale analizei performanței a 130 de probe de ser 73 4.6.2.Interpretarea analitică a celor 130 de probe din abordarea single-blind. 75 4.6.3 Evaluarea eșantionului colectiv de la Institutul de Biochimie din Köln. 76 4.7.1 Test de stabilitate la stocare a microarrays-urilor pentru hcg-i pe parcursul a douăsprezece săptămâni. 78 v
4.7.2 Test de stabilitate la depozitare a microarrays-urilor pentru hcg-β peste douăsprezece săptămâni. 80 4.7.3 Test de stabilitate a microarrays-urilor pentru LH peste douăsprezece săptămâni 81 A1. Cheia de probă a celor 130 de probe de ser pentru analiza performanței. 114 A2. Test de reactivitate încrucișată pe microarrays de detectare și anticorpi secundari la diferite concentrații de hcg-i în 1 x PBS. 118 A3. Test de reactivitate încrucișată pe microarrays de detectare și anticorpi secundari la diferite concentrații de hcg-i în materialul de referință. 119 A4. Test de reactivitate încrucișată pe microarrays de detectare și anticorpi secundari în materialul de referință. 120 A5. Determinarea efectelor matricei și a reactivităților încrucișate în probe complexe. 121 A6. Evaluarea colectivului eșantion de la Institutul de Biochimie din Köln. 122 A7. Test de stabilitate a microarrays-urilor pentru hcg-i peste douăsprezece săptămâni123 A8. Test de stabilitate a microarrays-urilor pentru hcg-β peste douăsprezece săptămâni. 124 A9. Test de stabilitate a microarraysului pentru LH peste douăsprezece săptămâni 125
Lista figurilor 2.1. Lista substanțelor interzise 2013 de către WADA. 11 2.2. Analiza probelor de dopaj. 13 2.3. Diagrama fluxului de lucru. 27 3.1. Modelul spot al microarrays-urilor. 40 4.1. SDS-PAGE pentru a verifica concentrația de proteine. 54 4.2. Rezumatul testului de reactivitate încrucișată pe microarray pe lamele de sticlă modificate GLYMO. 66 4.3. Seria de concentrare a gonadotropinei corionice umane hcg în 1 x PBS. 67 4.4. Seria de concentrare a hcg-β în 1 x tampon PBS. 68 4.5. Seria de concentrare a LH în 1 x tampon PBS. 69 4.6. Seria de concentrare a LH în ser complet. 70 VII
2.1. Termenul de dopaj și clasificarea claselor de substanțe în lista interzisă WADA Fig. 2.1.: Lista substanțelor interzise WADA 2013 (prescurtat). Clasele de substanțe (și exemplele) enumerate aici sunt interzise în orice moment în și în afara competițiilor. Hormonii peptidici enumerați la punctul S 2.2 (cutia roșie): gonadotropina corionică (CG) și hormonul luteinizant (LH) sunt interzise doar la bărbați, deoarece au un efect de reglare asupra cascadei de testosteron. Ambii hormoni sunt determinați din urină folosind imunoanalize. [WADA, 2012] 11
3. Lucrări materiale și experimentale și o bioactivitate de 14.000 U/mg. Aceasta corespunde unei bioactivități de 14.000 mu/pl în soluția stoc. Subunitatea β a hcg este disponibilă ca soluție stoc cu o concentrație de 0,1 mg/ml. Producătorul nu declară nicio bioactivitate pentru acest lucru. Conform [Stenman et al., 2006], bioactivitatea pentru hcg-β este dată ca 1 U/µg. În consecință, soluția stoc a hcg-β conține 100 U/ml sau 100 mu/pl. LH a fost prezent la o concentrație de 0,1 mg/ml. Tab. 3.2.3.: Schema de testare pentru detectarea unei posibile reactivități încrucișate a componentelor testului. Ca o matrice de probă, serul/sângele standard și serul/sângele de control au fost, de asemenea, testate în același mod ca tamponul 1 x PBS. Crucile reprezintă combinațiile de hormoni peptidici și anticorpi de detectare. anticorpi policlonali de detectare împotriva hormonului peptidic hcg-α hcg-β LH CRP - - - - x - - - - - x - - - - x - - - x - - - - x - - - 100 mu/ml LH - x - - - - x - - - - x - - - - x - - - 500 mu/ml hcg - x - - - - x - - - - x - - - - - - - 36 mu/ml hcg-β - x - - - - x - - - - x 42