Dinamica și agregarea proteinelor catalizate reglează funcțiile proteinelor Max Planck Society
Biocataliza
Fig. 1: Cisteina protează inactivă AvrRpt2 din Pseudomonas syringae este activată de peptidil-prolil-cis/trans-izomeraza ROC1 din Arabidopsis thaliana. Ambele proteine formează complexe Michaelis în care AvrRpt2 este substratul pentru ROC1 și în care procesul catalitic conduce la o creștere a ratei izomerizării reversibile cis/trans a legăturii critice prolil peptidice.
Oamenii de știință conduși de Gunter Fischer au identificat o reacție proteolitică în care ar trebui să fie posibilă compararea creșterii dinamicii lanțului unei proteaze inactive cu activarea funcției de protează în prezența unei legături peptidice.-cis/trans-Corelați izomeraza. Această reacție acționează ca o cale de semnalizare pentru răspunsul imun al unei plante la infestarea cu bacterie Pseudomonas syringae cunoscut. Cisteina protează inactivă AvrRpt2 este transferată către o plantă, peretele de cress, printr-un sistem de secreție de tip III al bacteriilor Arabidopsis thaliana, intrat în contrabandă. ROC1, un peptidil-prolil prototipic-cis/trans-Izomeraza în Arabidopsis, apoi activează funcția proteolitică a AvrRpt2 în așa fel încât anumite proteine de rezistență pot deveni acum eficiente (Fig. 1).
Fig. 2: Activarea funcției de protează a proteazei cisteinice inactive AvrRpt2 din Pseudomonas syringae se realizează cu ROC1, o ciclofilină prototipică din Arabidopsis thaliana. După cum arată profilurile HPLC ale amestecurilor de reacție, fragmentul AvrRpt272-255 (1,0 µM) poate rupe legătura peptidică Gly-Gly în oligopeptida fluorogenă Abz-IEAPAFGGWy-NH2 (y = 3-nitrotirozină) chiar în timpul unei incubații foarte lungi (255 h) la temperatura camerei nu împărțiți (C). ROC1 (10 uM) singur este, de asemenea, inactiv (B). Dacă, totuși, ambele proteine sunt amestecate cu oligopeptida în lotul de incubație, consumul de substrat aproape complet poate fi văzut după doar câteva secunde (vârf la 23,3 min) (A). Cele două produse de scindare Abz-IEAPAFG-OH (vârf la un timp de retenție de 17,2 min; MW 822,9 g/mol; m/z 823,2) și și H-GWy-NH2 (vârf la un timp de reținere de 15,2 min, MW 468,4 g/mol; m/z 469.1) rezultat din hidroliza catalizată a legăturii Gly-Gly. Este de asemenea afișat vârful CypA.
Aceste investigații dovedesc pentru prima dată că creșterea locală a dinamicii lanțului principal poate induce o proteină să elibereze o capacitate ascunsă anterior, aici cea a proteolizei unui substrat. În același timp, devine clar că acest mecanism joacă un rol nu numai în eprubetă, ci și în celula vie, de ex. B. în răspunsul imun al plantelor la infecțiile bacteriene. Oamenii de știință se află în prezent în procesul de identificare a prolinei responsabile de activarea AvrRpt2 în secvența sa de aminoacizi și obținerea de declarații despre structura și dinamica complexelor relevante Michaelis prin intermediul studiilor RMN (angajați: Cordelia Schiene-Fischer, Christian Lücke, Günther Jahreis).
Boala Alzheimer
Boala Alzheimer este cea mai frecventă cauză de demență în Germania. Boala se bazează probabil pe formarea depozitelor de proteine fibroase - așa-numitele fibrile amiloide. În boala Alzheimer, aceste fibre sunt formate din peptida Aβ. Cu toate acestea, este probabil ca fibrilele să nu fie factorul declanșator decisiv al bolii, ci mai degrabă precursorii lor structurali, care apar ca etape intermediare în procesul de formare. Între timp, a fost posibil să se izoleze mai multe dintre aceste etape intermediare de asamblare și să le investigheze biochimic. În micrografiile electronice se văd atât structuri sferice mici, așa-numiții oligomeri, cât și stări fibroase mai mari, cunoscute sub numele de protofibrile (Fig. 3). Pe lângă forma lor morfologică, structura moleculară mai precisă a acestor intermediari a rămas ascunsă mult timp. Împreună cu grupurile de lucru din Magdeburg, Leipzig și Jena, Marcus Fändrich a reușit acum să obțină informații detaliate despre structura acestor intermediari oligomerici și protofibrilari.
Imagini la microscopul electronic al fibrilelor amiloide (stânga) și a diferiților intermediari de asamblare, cum ar fi protofibrilele (mijloc) și oligomerii (dreapta). Bara de scalare corespunde 200nm.
Lucrarea la structura intermediarilor protofibrilari și oligomerici a fost posibilă prin faptul că diferite etape intermediare ar putea fi stabilizate pentru o perioadă suficient de lungă de timp folosind procese adecvate și astfel au devenit accesibile metodelor de cercetare biofizică. În cazul etapelor intermediare protofibrilare, acest lucru a fost realizat printr-o descoperire de șansă anterioară. Grupul de lucru a constatat că un fragment de anticorp pe care l-a izolat este capabil să intervină într-o etapă specifică a procesului de asamblare și să prevină conversia încurcăturilor protofibrilare în fibrile amiloide. În acest fel, protofibrilele Aβ ar putea fi supuse unei investigații structurale mai aprofundate folosind așa-numita spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară în stare solidă. Această metodă spectroscopică face posibilă observarea atomilor individuali în cadrul unei molecule și a mediului lor chimic.
Fändrich și echipa sa au aflat ce elemente structurale stabilizează etapele intermediare de asamblare și cum acestea diferă între ele și de fibrilele amiloide adulte în diferite etape intermediare. S-a constatat că intermediarii - asemănători fibrilelor amiloide - au o structură β-sheet, dar că aceasta este aranjată diferit în comparație cu etapele de asamblare ulterioare. Identificarea elementelor stabilizatoare în intermediarii amiloizi este o condiție esențială crucială pentru dezvoltarea inhibitorilor vizați care împiedică formarea unor astfel de structuri. În activitatea sa în desfășurare, grupul dezvoltă, prin urmare, metode bazate pe peptide pentru a interveni în mecanismul de formare a structurilor proteice neurotoxice. Primele rezultate sunt promițătoare și indică un efect de neutralizare a toxicității. Pe termen lung, se speră să se poată obține noi puncte de atac sau structuri țintă pentru dezvoltarea terapiei.
Chaperone PDI și proteine client
ERp46 este diferit de ERp29 prin faptul că poate îndeplini o funcție catalitică în reacțiile redox. La diferite concentrații de glucoză, este exprimat diferit în celulele ß ale insulelor Langerhans din țesutul pancreatic și ar putea servi și pentru controlul semnalelor adiponectinei. Diferența în proprietățile de legare pentru ERp29 și ERp49 este evidentă în bibliotecile de peptide menționate mai sus. Din aceasta s-a dedus că ERp46 poate interacționa cu ERp29 în două puncte diferite. Pentru a înțelege mai bine aceste interacțiuni molecular, al treilea domeniu al ERp46 (domeniul a´) a fost cristalizat. În acest context, este interesant faptul că la șoarecii deficienți în ERp29, ERp46 este suprareglat și, în același timp, sunt afectate și proteinele care controlează metabolismul acizilor grași. Pentru a testa aceste relații, șoarecii knock-out ERp29 au fost supuși unei diete bogate în grăsimi și au fost analizați pentru capacitatea lor de a prelua glucoza din sânge (Fig. 4d). În timp ce șoarecii de tip sălbatic au prezentat un profil de absorbție redus semnificativ, care este caracteristic intoleranței la glucoză în diabet, un profil îmbunătățit semnificativ se găsește pentru șoarecii knock-out ERp29 (P.