Evaluarea funcției microvasculare a țesutului adipos uman utilizând protocolul de videomicroscopie

rezumat

Sistemele de videomicroscopie sunt utilizate pentru a studia proprietățile funcționale ale arteriolelor țesutului adipos izolate ca răspuns la stimulii fiziologici și farmacologici. Această tehnică poate fi utilizată pentru a examina fenotipurile microvasculare în diferite domenii ale țesutului adipos la persoanele obeze.

Abstract

Introducere

Laboratorul nostru aplică videomicroscopie pentru a investiga relația dintre obezitate și disfuncția vasculară, cu accent pe efectele diferitelor domenii de țesut adipos asupra vasculaturii. Obezitatea centrală cu acumulare de grăsime viscerală intraabdominală este cel mai probabil asociată cu producția de adipocitokine, tulburări metabolice și risc cardiometabolic. S-a postulat că disfuncția țesutului adipos cu supraproducție de citokine pro-aterogene și dereglarea adipokinei este puternic implicată în aceste procese, dar anumite molecule de reglare și obiective de tratament rămân nedetectate. 4 De altfel, la nivelul țesutului adipos local, subțierea capilară și afectarea fluxului sanguin au fost legate de pseudohipoxia țesutului adipos și de dereglarea metabolică. Ipoteza că bolile cardiovasculare dezvoltă posibil rezultatul unei disfuncții a țesutului adipos. Mediatorii pro-aterogeni din grăsimi, în special cei asociați cu obezitatea medie/viscerală, sunt susceptibili de a promova disfuncția endotelială și modificările vasculare ale agenților patogeni care se pot manifesta local în vasculatura adiposă și detectarea utilizând metodologia descrisă aici. 5

Evaluarea funcțională a arteriolelor țesutului adipos izolate este o abordare utilă pentru înțelegerea fiziopatologiei și a mecanismelor moleculare care contribuie la disfuncția vasculară la obezitatea umană. Pentru a investiga mecanismele care contribuie la disfuncția specifică depozitului de grăsime, am folosit metode pentru a testa răspunsurile vasodilatatoare dependente de endoteliu și independente din microvasculatură și valorificăm expresia diferiților candidați de reglare în probe de țesut adipos cuplate visceral și subcutanat (SC) Subiecți obezi la momentul intervenției chirurgicale bariatrice.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Protocolul și exemplele descrise aici au fost aprobate de Comitetul de revizuire instituțională al Școlii de Medicină a Universității din Boston (IRB, Protocol # H-25644) și au fost realizate în conformitate cu Declarația de la Helsinki. Toți subiecții au acordat acordul scris înainte de participare.

1. Pregătiți soluțiile și canulele din micro-sticlă

2. Pregătiți reactivii

  1. se prepară acetilcolina (ah, 10 -2 M, soluție stoc). Se dizolvă 18,29 g în 10 ml apă deionizată. Se economisesc 1 ml alicote din soluția mamă (10 -2 M) la -80 ° C. Diluat serial în ziua experimentului pentru a obține următoarele concentrații de lucru: 10 -5, 10 -9, 10 -6, 10 -7, 10-8 M.
  2. Pregătiți papaverina (2 x 10 -2 M, soluție stoc). Se dizolvă 0,07517 g în 10 ml apă deionizată. Se prepară 10 pl alicote din soluția stoc și se diluează în serie la -80 ° C pentru a obține 10 -4, 10 -5, 10 -6, 10 -7 10 -8 M în ziua experimentului.
  3. Pregătiți endotelina-1 (ET-1, 2 x 10 -5 M, soluție stoc). Se dizolvă 50 ug endotelină-1 în 1 ml 1% BSA/PBS. Se economisesc 1 ml alicote din soluția stoc (2 x 10 -5 M) la -80 ° C. Se diluează în ziua experimentului pentru a obține o concentrație de lucru de 10-10 M în ziua experimentului.
  4. Păstrați reactivii la -20 ° C sau până la -80 ° C, în funcție de tipul de congelator disponibil, dar nu mai mult de 6 luni.

3. Colectarea țesutului adipos și pregătirea vaselor

4. Evaluarea funcției microvasculare obeze

Notă: în general, vasodilatația dependentă de endoteliul arteriolar adipos poate fi indusă ca răspuns la stimuli fiziologici (induși de flux) și farmacologici (induși de Ach).

  1. Vasodilatație dependentă de endoteliu, mediată de flux
    1. după presurizare, se înregistrează diametrul arteriolei adipoase în repaus (Di). Aceasta se numește diametrul de bază de repaus.
    2. Înainte de restrângerea vaselor de sânge,

    55% din diametrul inițial de odihnă (Dp) prin adăugare de 1 pl de endotelină-1 (ET-1, 10-10 M) direct în cadă și așteptând 5 minute. Repetați acest proces până când îl atingeți pe cel dorit

    5. Analiza și calculul datelor

    1. calculați reactivitatea vasculară. Utilizați procentul de vasodilatație pentru tipărirea datelor, luând în considerare diferențele de bază în diametrul vasului și calculând folosind următoarea ecuație:
      % Vasodilatație (DT-Dp/Di-Dp) x 100 =
      unde DT este diametrul înregistrat la un moment dat (diametrul maxim), Dp este diametrul înregistrat după adăugarea agentului de vasoconstricție (adică ET-1 a cauzat diametrul de îngustare), iar Di este diametrul care a fost imediat înainte de adăugarea agentului de vasoconstricție (diametrul de bază în repaus) înregistrat. 9
    2. Definiți sensibilitatea vasodilatației și vasoconstricției (doză-răspuns) la un agonist ca concentrație de Ach, Papaverină sau ET-1 care determină 50% din răspunsul maxim (EG 50) definit de un parametru sigmoid și reprezentat grafic așa cum s-a descris anterior. 10
      NOTĂ: studiile de reproductibilitate între observatori ale vasodilatației microvaselor adipoase au un coeficient de corelație ridicat (CC) de 0,99 (n = 10 experimente Schiff) în laboratorul nostru.

    1. Expresia măsurătorilor continue ca ± SEM înseamnă că acestea tind să fie distribuite în mod normal. Analizați reactivitatea vasculară în arteriolele adipoase prin acțiune repetată ANOVA cu două căi.
    2. Alternativ, comparați zona de sub curbă (ASC) de acțiune pentru vasodilatație cumulativă cu răspunsurile la doză între grupurile de tratament. În toate cazurile, luați în considerare abonamentul P necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Rezultate reprezentative

    Laboratorul nostru a folosit videomicroscopie pentru a examina vasodilatația dependentă de endoteliu și funcția vasocontractilă a țesutului adipos, arteriolele izolate din țesutul adipos subcutanat și visceral de la persoanele obeze. Configurarea experimentală caracteristică este prezentată în Figura 1Aafișat. Arteriolele țesutului adipos sunt suspendate între două pipete de sticlă capilare și fixate cu suturi în camera organelor, ca în Figura 1bafișate. După cum este descris mai sus în secțiunea 5.1, răspunsurile arteriolare pot fi apoi evaluate prin examinarea vasului la momentul inițial (Figura 2A), urmată de pre-îngustare cu ET-1

    55% din diametrul de bază (Fig. 2 b) și apoi vasodilatația și relaxarea indusă de agonist a lumenului vascular ca în Figura 2afișate.

    evaluarea
    Figura 1: Structura microscopiei video. (A.) Imagine care descrie componentele camerei de organe a videomicroscopiei. (B.) Imaginea unei arteriole de țesut adipos uman montată între două pipete capilare de sticlă în camera organelor. Diametrul lui Schiff se modifică ca răspuns la stimulii fiziologici și farmacologici, care pot fi examinați și cuantificați utilizând un software de analiză și un atașament inversat al camerei specializat în sistem. Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

    funcției
    Figura 2: Vizualizarea vasodilatației microvasculare cu microscopie video sub presiune. (A.) diametrul arteriolelor inițiale de repaus (diametrul post-presurizare, fără agonist sau stimulare: marți) (B.) diametre îngustate deja (diametre îngustate induse după ET-1: Dp), (C.) Scăderea diametrului indusă de agoniști (după ce s-a adăugat Ach: DT). Faceți clic aici pentru o versiune mai mare a acestei figuri.

    evaluarea
    Figura 3: Vasodilatație dependentă de endoteliu și independentă în subcutanat vs. arteriole ale țesutului adipos visceral la persoanele obeze. Vasodilatația dependentă de endoteliu a fost atenuată semnificativ la nivelul viscerului comparativ cu arteriolele adipoase subcutanate de (A.) Evaluarea debitului crescut (vase subcutanate și viscerale asociate, n = 20) sauB.) Răspunsul la doza de acetilcolină cu/fără L-NAME (vase subcutanate și viscerale împerecheate, n = 16). (C.) Vasodilatația independentă de endoteliu nu s-a modificat diferențial între arteriolele viscerale și subcutanate atunci când s-a evaluat răspunsul la doza de papaverină (vase subcutanate și viscerale asociate, n = 8). * Indică diferențele de grup între depozite; † Denotă diferențe specifice depozitului între acetilcolină și L-NAME în comparație cu acetilcolina singură; NS: nu semnificativ. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM, p Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Discuţie

    Disecția și izolarea arteriolelor obeze din țesuturile înconjurătoare poate fi un proces intensiv în timp și muncă, cu o atenție atentă la detalii și protocol tehnic. Procedura de microdisecție necesită abilități atente și accesorii specializate de disecție pentru a evita posibile deteriorări ale mușchilor netezi sau straturilor endoteliale ale celulei de microvasculatură. Chiar și cea mai mică puncție accidentală din peretele arteriolar poate preveni presurizarea intraluminală și poate duce la o încercare nereușită. În plus, canularea arteriolelor cu suturi este critică pentru a asigura arteriolele între vârfurile pipetei sticlă-capilare la fiecare capăt al vasului.

    Microvasele izolatoare umane pot dezvolta tonus miogenic spontan după 30-40 min de presurizare la 60mmHg. Cu toate acestea, am constatat că dimensiunile arteriolelor adipose umane de obicei 50-350 µm din diametrul luminal intern sunt relativ mici, cu straturi rare de celule musculare netede vasculare și nu tind să dezvolte un ton miogen semnificativ în comparație cu arteriolele musculare scheletice. Astfel, declanșăm pre-îngustarea acestor mici arteriole cu ET-1 înainte de expunerea la vasodilatatoare. Găsim că ET-1 exercită un răspuns vasoconstrictor mai fiabil în timp ce, în unele cazuri, poate exista variabilitate în răspunsurile la agoniști ai receptorilor alfa, cum ar fi fenilefrina. Este imperativ să folosiți agonistul adecvat pentru a induce unul dorit

    55% pre-gât pentru a alege; Cu toate acestea, este, de asemenea, important să alegeți cantitatea potrivită de agent de pre-constricție peste doză și să preveniți deteriorarea toxică a vasului. Pentru a realiza acest lucru, începem cu rândul de doză inferior și titrăm în sus, așa cum este descris în secțiunea 4.1.2.

    Arteriolele din țesutul adipos sunt sensibile la modificările pH-ului și temperaturii; 14 este deci crucial să monitorizăm și să controlăm pH-ul (7,4) și temperatura (37 ° C) corespunzătoare în timpul procedurii experimentale. În timp ce videomicroscopia este o temperatură controlată strict controlată, este imperativ să se monitorizeze pH-ul soluției în experiment pentru a evita schimbările care pot distorsiona rezultatele. Clocotirea continuă a soluției CANCER și a soluției de înlocuire la fiecare 15 minute în timpul etapelor de presurizare și spălare va reduce fluctuațiile pH-ului în timp.

    Videomicroscopia este o tehnică utilă pentru a studia proprietățile funcționale ale microvasculaturii, tehnica are o curbă semnificativă de învățare și potențial intensivă în muncă, în special în timpul procesului de izolare vasculară. În funcție de tipul de țesut biopsiat, experiența noastră cu microvasculatura țesutului adipos a arătat că procedura de canulare poate necesita o cantitate semnificativă de timp și răbdare. În plus, există o sensibilitate inerentă la timp a experimentelor, deoarece vasele din afara corpului tind să-și piardă proprietățile fiziologice și funcționale în timp. Astfel, experimentele trebuie efectuate în ferestrele viabile ale vaselor la câteva minute până la ore după biopsia chirurgicală înainte de orice decădere a țesutului.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Dezvăluiri

    Autorii nu au detalii sau conflicte de interese de raportat.

    Mulțumiri

    Autorii ar dori să mulțumească voluntarilor pentru participarea la aceste studii și personalului chirurgical de la Boston Medical Center pentru furnizarea de biopsii de țesut adipos. Dr. Gökce este susținut de subvențiile Institutelor Naționale de Sănătate (NIH), HL081587, HL114675 și HL126141. Dr. Culoarea se bazează pe acordarea NIH K23 HL135394.