Extracția ADN-ului de mare viteză și genotiparea larvelor de pește zebră 3dpf prin protocolul de tăiere a pinilor

rezumat

Peștele zebră a fost utilizat ca organism genetic model de încredere în cercetarea biomedicală, în special odată cu apariția tehnicilor de modificare genetică. Când se suspectează fenotipuri larvare, identificarea ADN-ului de extracție și a genotipului poate fi dificilă. Aici, descriem o procedură eficientă de genotipare pentru larvele de pește zebră, prin tăierea cozii, încă din 72 de ore după fertilizare.

Abstract

Introducere

Peștele zebră (Danio rerio) este un organism vertebrat utilizat pe scară largă ca model pentru investigarea bolii, precum și pentru testarea preclinică a ipotezelor terapeutice 1, 2, 3. Aceste animale au un timp de generație scurt, ușor de manevrat, prezintă o rată mare de reproducere, costuri reduse și se pretează cu ușurință manipulării genetice prin microinjecție a ADN-ului în 4 embrioni. Prin dezvoltarea în creștere a noilor tehnologii transgenice și de editare genică, cum ar fi Zinc Fucle Nucleases (ZFN) 5, nucleozele efectoare de tip TAL (TAPS) 6, 7 și sistemul de repetări scurte palindromice (CRISPR)/CRISPR cluster 9 (Case9) 8, peștele zebră este pregătit să îmbunătățească semnificativ înțelegerea mai multor condiții patologice. Aceste tehnologii au fost utilizate pentru a crea deschideri vizate atât în ​​celulele somatice, cât și în celulele germinale din peștele zebră, antrenând în mod eficient animale modificate genetic 8. Exemple recente din literatură, inclusiv dezvoltarea modelelor genetice ale epilepsiei și tulburărilor metabolice la peștele zebră 3, 9, 10, 11, 12 .

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Procedurile cu subiecți de animale au fost aprobate și sunt conforme cu liniile directoare de îngrijire a animalelor stabilite de Comitetul canadian pentru îngrijirea animalelor și Comitetele de îngrijire a animalelor de la Universitatea din Ottawa.

  1. Pregătirea suprafeței de disecție prin bandă un capac de 9 cm din caseta Petri cu bandă de autoclavă pe suprafața sa interioară. Poziționați-l sub un stereomicroscop.
  2. Locul fertilizării după 3-5 zile (dpf) de larve de pește zebră într-o cutie Petri și anesteziat în ~ 1,5 mM tricaină în mediu embrionar x E3 1 (NaCl 5 mM, KCl, 0,33 mM CaCl2, 0, 33 mM MgSO4, 0,17 mM, pH 7,2).
  3. Tăiați capătul vârfului unei pipete P1000 cu o foarfecă sau o lamă de ras la un diametru de 2 mm pentru a găzdui o larvă dpf 3 cu stres minim.

2. tăierea finală a larvelor de pește zebră

3. Extracția ADN genomic

  1. Sigilați placa PCR cu 96 de godeuri și centrifugați probele la 1000 x g timp de 1 min pentru a vă asigura că toate hârtia de filtru sunt scufundate în soluția de NaOH.
  2. Pentru liza țesuturilor, se încălzesc probele într-un ciclotermic la 95 ° C timp de 5 minute, urmate de răcire la 4 ° C timp de 10 minute.
  3. Se adaugă 6 μL de 500 mM Tris-HCI, pH 8,0 la fiecare probă. Vortex.
  4. Centrifugați scurt placa la 1500 xg, timp de 5 minute la temperatura camerei.
  5. Utilizați 1,5 μL de supernatant ADN per reacție PCR.
  6. Pregătiți un PCR pentru a genotipa larvele, așa cum este indicat în tabelul 1-2.
    Notă: Acest protocol a fost testat în două aplicații: reacții multiplex PCR care dezvăluie genotipul utilizând geluri de agaroză 9 și test heteroduplex turn (HMA) care dezvăluie genotipuri folosind gel de poliacrilamidă (PAGE). Electroforeză 17 .

4. extracție genomică alternativă folosind o rășină de chelare

  1. Finalizați pasul 2.5 prin adăugarea hârtiei de filtru cu aripioara tăiată pe o placă PCR cu 96 de godeuri, conținând 30 μL de rășină chelantă 5% (copolimer stiren-divinilbenzen conținând ioni Iminodiacetat împerecheați).
    Notă: Acest tip de rășină este utilizat în mod obișnuit pentru liza țesuturilor și prepararea ADN-ului pregătit pentru PCR într-un mod rapid și eficient 18 .
  2. Urmați pașii 2.6-2.8 așa cum se arată.
  3. Plasați PCR cu 96 de godeuri și centrifugați scurt probele pentru a vă asigura că toată hârtia de filtru este încorporată în rășina de chelare.
  4. Pentru liza țesuturilor, se încălzesc probele într-un ciclotermic la 95 ° C timp de 15 minute, urmate de răcire la 4 ° C timp de 10 minute.
    Notă: Acest pas permite liza și legarea ulterioară a mărgelelor de rășină polară la componentele celulare în timp ce ADN-ul și ARN-ul rămân în soluție.
  5. Pe scurt, centrifugați probele pentru granulele de rășină de pelete și obțineți ADN în suspensie.
  6. Urmați pașii de la 3.5 la 3.6 pentru a finaliza procedura de genotipare.

5. cerere 1: PCR multiplex urmată de analiza gelului de agaroză

6. aplicație 2: Test Heteroduplex din fontă

  1. Pregătiți PAGE 12% geluri folosind placa distanțieră de 1,5 mm și piepteni cu 15 probe. Se prepară două geluri PAGE folosind 12,21 ml ddH2O, 2,52 ml 10 x Tris/Borat/EDTA (TBE), 10 ml 30% acrilamidă, 250 μL persulfat de amoniu 10% (APS) și 20 μL de tetrametiletilendiamină (TEMED). Utilizați 1 x tampon TBE (0,089 M Tris-HCI, 0,089 M acid boric și 0,002 M acid tetraacetic (EDTA)) în tampon.
  2. Încălziți produsele PCR la 94 ° C timp de 5 minute.
  3. Răciți tuburile pe gheață sau în termociclatorul timp de 10 minute la 4 ° C.
  4. Încărcați 10 μL/probă PCR și 8 μL de marker de greutate moleculară.
  5. Rulați PAGE la 150 V 1 x TBE folosind un sistem de electroforeză verticală timp de 1 oră sau până când markerul de greutate moleculară aproape ajunge la linia de jos a plăcii de sticlă.
  6. Gelul UV care permite discriminarea diferitelor genotipuri ale imaginii.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

30 pl. Extracția ADN utilizând rășină de chelare are ca rezultat un randament similar, 0,5 în medie 3,8 ng/µL de ADN, de exemplu. Această cantitate de ADN colectat din larvele de aripi generează ADN genomic gata de PCR de o calitate suficientă pentru a permite identificarea genotipurilor. Fiecare probă de ADN poate fi utilizată în reacții de amplificare PCR ~ 30. Produsele de amplificare obținute folosind primerii Gen1_FW și Gen2_RV pot fi, de asemenea, utilizate pentru secvențierea aplicațiilor 9, care au identificat inserția de 5 bp în mutanți homozigoti (aldh7a1 -/-) (Figura 3 ). Secvențierea Sanger a fost efectuată de un serviciu extern pentru a verifica dacă produsele PCR nu sunt adecvate pentru această aplicație. Probele de ADN cu gel de agaroză au confirmat mutanți homozigoti și s-au utilizat WT (n = 3). S-au obținut scoruri ridicate de 19 Phred (> 30) indicând citiri de înaltă calitate, cu excepția primei și ultimelor 40 de perechi de baze.