Genomi

Jürgen Markl

12 Institutul de Fiziologie Moleculară, Universitatea Johannes Gutenberg, Mainz, Germania

David Sadava

13 Keck Science Center, Claremont, CA, SUA

David M. Hillis

14 Universitatea Texas din Austin, Austin, TX, SUA

H. Craig Heller

15 Universitatea Stanford, Stanford, CA, SUA

Sally D. Hacker

16 Oregon State University, Corvallis, OR, SUA

Andreas Held

Birgit Jarosch

7 Jarsoch Text, Aachen, Renania de Nord-Westfalia Germania

Lothar Seidler

Monika Niehaus-Osterloh

Eva Sixt

10 München, Bayern Germania

Matthias Delbrück

Fascination Research: The Dog Genome Project

Canis lupus familiaris, câinele domestic, a fost domesticit de oameni în urmă cu aproximativ 15.000 de ani. Deși există multe varietăți diferite de lupi, aceștia sunt destul de asemănători, dar nu este cazul „celui mai bun prieten al omului”. Fédération Cynologique Internationale (FCI), cea mai mare organizație umbrelă din lume pentru crescătorii de câini, recunoaște peste 300 de rase de câini. Geneticienii presupun în jur de 100 de rase reale de câini, restul sunt soiuri. Nu numai că rasele de câini arată destul de diferit, dar și ele variază foarte mult în înălțime. De exemplu, Chihuahua mediu cântărește doar 1,5 kg, în timp ce un câine scoțian cântărește 70 kg. Niciun alt mamifer nu prezintă o variabilitate fenotipică atât de mare. Există, de asemenea, sute de boli genetice la câini, iar multe dintre ele au omologii lor la oameni. Proiectul genomului canin a început la sfârșitul anilor 1990 pentru a afla care gene sunt responsabile de variabilitatea genetică și cum sunt legate genele de boli.

Fascination Research: The Dog Genome Project

Primii doi câini care au avut genomul complet secvențiat au fost un boxer și un pudel. ADN-ul genomului canin cuprinde 2,8 miliarde de perechi de baze în 39 de perechi de cromozomi. Conține 19.000 de gene care codifică proteinele, dintre care majoritatea au un omolog la alte mamifere, inclusiv la oameni. Folosind secvența completă a genomului, au început să mapeze markerii genetici - secvențe ADN scurte specifice - la anumite poziții din genom care diferă la câini individuali sau la rase de câini.

Markeri genetici servesc la localizarea (și astfel identificarea) genelor care controlează anumite caracteristici. De exemplu, Elaine Ostrander și grupul ei de cercetare studiază câinii de apă portughezi pentru a identifica genele care controlează mărimea corpului. Îndepărtarea celulelor pentru izolarea ADN-ului a fost relativ ușoară: ați trecut un tampon de bumbac peste interiorul obrazului. S-a dovedit că gena factorului de creștere asemănător insulinei 1 (IGF-1) este importantă în determinarea dimensiunii corpului: rasele mari au o alelă care codifică IGF-1 activ, în timp ce rasele mici au o alelă poartă o alelă pentru un IGF-1 mai puțin activ.

Așa cum era de așteptat, unii oameni de știință au înființat companii care să testeze câinii pentru variante genetice pe baza ADN-ului și astfel să confirme „puritatea rasei” proprietarilor de câini în cauză. În mod similar, genomul pisicilor domestice, pisicilor sălbatice și al diverselor specii de pisici mari a fost secvențiat. Comparațiile acestor genomi de animale ajută la determinarea istoriei evolutive a diferitelor linii de mamifere și, de asemenea, la identificarea genelor care sunt responsabile de boli și forme de trăsături pe măsură ce apar la diferitele specii de mamifere. Astfel de investigații nu sunt, desigur, limitate la mamifere, dar există proiecte de genom în regnul animal, inclusiv plante, ciuperci, multe alte eucariote și numeroși procariote.

Ce cunoștințe am dobândit prin secvențierea genomului animalelor?

Veți găsi răspunsuri la această întrebare în „Experiment: Analiza comparativă a genomului tigrului” în sect. 17.1 și în „Cercetarea fascinației” la sfârșitul acestui capitol.

Genomurile pot fi acum secvențiate foarte repede

În Secvențierea genomului se determină secvența nucleotidică a întregului genom al unei ființe vii. La un procariot care are un singur cromozom, secvența genomului este o secvență continuă de perechi de baze (bp). Într-o specie diploidă, cu reproducere sexuală, cu autozomi multipli și o pereche de cromozomi sexuali (Secțiunea 10.1007/978-3-662-58172-8_12 # Sec22), termenul „genom secvențiat” se referă de obicei la secvența tuturor bazelor dintr-un haploid Set de autozomi și cei doi cromozomi sexuali (la om 22 + 2, la câini 38 + 2).

Pe scurt

Genomurile sunt secvențiate sub formă de fragmente scurte care sunt mapate între ele folosind suprapuneri.

În genomica funcțională, informațiile secvenței sunt utilizate pentru a determina funcțiile diferitelor părți ale genomului.

În genomica comparativă, se compară secvențele genomice ale diferitelor organisme.

Odată cu progresele în tehnologia de secvențiere a ADN-ului, a existat o explozie de informații genetice pe care oamenii de știință le pot folosi într-o varietate de moduri.

Se poate compara genomul diferitelor specii pentru a vedea cum diferă acestea la nivel de ADN. Aceste informații pot fi apoi utilizate pentru a înțelege relațiile evolutive.

Se pot compara secvențele indivizilor dintr-o specie pentru a identifica mutațiile care determină anumite fenotipuri.

Informațiile secvenței pot fi utilizate pentru a identifica gene pentru anumite tipuri de trăsături, cum ar fi genele care sunt legate de boli.

Secvența ADN a genelor care codifică proteinele poate fi găsită și secvența de aminoacizi a proteinelor în cauză poate fi dedusă din aceasta, dacă aceasta este încă necunoscută.

Secvența de bază a unui fragment scurt de ADN poate fi determinată rapid

Abilitatea de a secvența întregul genom al unui organism complex nici măcar nu a fost luată în considerare înainte de 1986. Cu toate acestea, laureatul Premiului Nobel Renato Dulbecco și alți oameni de știință au sugerat la acea vreme comunitatea științifică din întreaga lume să fie mobilizată pentru a aborda secvențierea întregului genom uman. Unul dintre motive a fost acela că persoanele care au supraviețuit bombardamentelor atomice din Japonia în timpul celui de-al doilea război mondial și care au fost expuse la radiații ar trebui să fie examinate pentru eventuale deteriorări ale ADN-ului. Dar pentru a putea determina modificările genomului uman, mai întâi trebuia cunoscută secvența acestuia.

Deci a fost finanțat din bani publici Proiectul genomului uman lansat, o întreprindere uriașă care a fost finalizată cu succes în 2003 - considerabil mai devreme decât se aștepta. Aceste eforturi au fost sprijinite și completate de grupuri cu finanțare privată. Proiectul a beneficiat de dezvoltarea a numeroase metode noi și revoluționare care au fost aplicate mai întâi la secvențierea genomilor mai mici - de la procariote și pur și simplu eucariote construite, cum ar fi organismele model pe care le-ați întâlnit în capitolele anterioare ale acestei cărți. Multe dintre aceste metode sunt utilizate pe scară largă astăzi, incluzând metode complet noi special pentru secvențierea genomului. Evoluțiile metodologice din acest sector sunt în curs de desfășurare. Aceste metode sunt completate de metode noi pentru a studia diversitatea fenotipică a proteinelor și a produselor metabolice dintr-o celulă. O cerință de bază a fost și este dezvoltarea dramatică în continuare a hardware-ului și software-ului computerului pentru a putea face față cantităților uriașe de date care apar.

Multe procariote au un singur cromozom, în timp ce eucariotele au mulți cromozomi. Datorită dimensiunilor lor diferite, cromozomii pot fi separați ușor unul de celălalt. Cea mai simplă metodă pare să fie aceea de a începe secvențierea unui cromozom la un capăt și pur și simplu secvențierea întregii nucleotide a moleculei de ADN cu nucleotidă. Sarcina este oarecum simplificată de faptul că numai una dintre cele două fire trebuie să fie secvențiată, deoarece cealaltă este complementară acesteia. Uită-te la secvență

atunci cealaltă suvită trebuie să arate astfel:

Cu toate acestea, chiar și cu metodele actuale, secvențierea unei molecule de ADN care are milioane de perechi de baze lungi de la un capăt la altul nu este posibilă și nici nu este necesară. Cu această strategie, cel puțin câteva mii de perechi de baze pot fi secvențiate simultan. Pentru a determina o secvență a genomului, firul de ADN lung de câțiva centimetri al unui cromozom trebuie să fie împărțit în multe fragmente scurte de ADN, iar apoi mii de astfel de fragmente sunt secvențiate în același timp.

În anii 1970, Frederick Sanger și colegii săi au inventat o metodă prin care ADN-ul poate fi secvențiat folosind nucleotide modificate chimic. Aceste nucleotide au fost inițial concepute pentru a opri divizarea celulelor canceroase. Această metodă (sau o variantă a acesteia) a fost utilizată pentru a determina prima secvență genomică a oamenilor și a mai multor organisme model. Cu toate acestea, conform standardelor actuale, metoda este relativ lentă, costisitoare și intensivă în muncă. În primul deceniu al noului mileniu, au fost dezvoltate metode mai rapide și mai ieftine, adesea denumite Secvențierea cu randament ridicat rezumă. Aceste metode utilizează o tehnică miniaturizată dezvoltată inițial pentru industria electronică și mecanismele de replicare a ADN-ului, adesea în combinație cu Reacție în lanț a polimerazei (PCR).

Referință încrucișată

PCR poate fi automatizat; este o metodă importantă pentru secvențierea unor cantități mici de ADN. Detalii despre PCR pot fi găsite în secțiunea 10.1007/978-3-662-58172-8_13 # Sec23.

Metodele de secvențializare cu randament ridicat, rezumate, de asemenea, la termen Secvențierea generației următoare (NGS), sunt rapid îmbunătățite. Una dintre numeroasele abordări este prezentată aici și este prezentată în Fig. 17.1. În primul rând, fragmentele de ADN sunt pregătite pentru secvențierea prin legarea lor de un suport solid și amplificarea ADN-ului prin PCR (Fig. 17.1 a):

O moleculă mare de ADN este împărțită în fragmente scurte de aproximativ 100 bp fiecare. Acest lucru se poate face fizic prin crearea forțelor mecanice de forfecare care rup ADN-ul. Sau se utilizează enzime care hidrolizează legăturile fosfodiesterice dintre nucleotidele din coloana vertebrală a ADN-ului la anumite intervale.

ADN-ul este denaturat de căldură, rupând legăturile de hidrogen care țin cele două fire împreună. Fiecare catenă acționează apoi ca un șablon pentru sinteza de ADN nou, complementar.

Oligonucleotidele sintetice scurte sunt atașate la capetele fiecărui fragment și acestea sunt atașate la un suport solid.

Fragmentele de ADN sunt amplificate prin PCR. Se folosesc grunduri care sunt complementare oligonucleotidelor sintetice la capetele fragmentelor de ADN individuale. Deoarece aproximativ 1000 de copii de ADN sunt atașate la fiecare poziție, nucleotidele nou adăugate pot fi ușor detectate în timpul etapelor de secvențiere.