Inducerea aterosclerozei accelerate la șoareci Protocolul modelului de leziune a firului (tradus în

rezumat

Acest studiu descrie o metodă invazivă de inducere a aterosclerozei accelerate la șoareci. În comparație cu alte metode care utilizează leziuni electrice sau crio-induse, leziunea indusă mecanic imită starea umană de restenoză după terapiile de revascularizare și este ideală pentru studierea mecanismelor moleculare implicate.

Abstract

Ateroscleroza este o boală fibro-inflamatorie proliferativă care se dezvoltă în peretele arterial și induce un flux sanguin deficitar sau o deficiență a fluxului sanguin. În plus, arterioscleroza induce formarea trombului ocluziv prin ruperea peretelui vasului defect, care este principala cauză de infarct miocardic sau accident vascular cerebral și cea mai frecventă cauză de deces. În ciuda progreselor în domeniul cardiovascular, multe întrebări rămân fără răspuns și cercetarea de bază suplimentară este esențială pentru a ne îmbunătăți înțelegerea mecanismelor moleculare implicate în ateroscleroză și implicațiile acesteia. Datorită studiilor clinice limitate, sunt necesare modele animale reprezentative care să simuleze bolile aterosclerotice, cum ar fi formarea neointimală după implantarea stentului, angioplastia cu balon sau endarterectomia. Deoarece șoarecele are multe avantaje și este cel mai utilizat model pentru studierea proceselor moleculare, studiul actual propune o metodă invazivă de denudare endotelială, cunoscută și sub denumirea de model de leziune a firelor, care este reprezentativă pentru condiția umană a formării neointimei în artere după procedurile de revascularizare. este.

Introducere

Principalul dezavantaj al modelului de șoarece este dimensiunea redusă a principalelor artere expuse bolii aterosclerotice (artera carotidă, aorta și artera femurală) care necesită cunoștințe și abilități chirurgicale calificate pentru a manipula vasele și a induce invaziv placa aterosclerotică. Prin urmare, modelul de formare accelerată a neointimelor propus în această lucrare în contextul restenozei după endarterectomie sau stentare este prezentat cu o orientare pas cu pas și sugestii pentru a facilita introducerea personalului interesat. Un alt dezavantaj este că denudarea apare pe peretele arterial normal și, prin urmare, formarea neo-intima va fi moderată în comparație cu situația clinică. Nivelurile ridicate de colesterol plasmatic realizate la șoarecii Apolipoprotein E Knockout (Apoe -/-), hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi creează un mediu proinflamator adecvat necesar formării neo-intime.

Operația se efectuează la microscop stereo. Artera carotidă este expusă printr-o incizie mediană în zona cervicală anterioară. Structurile anatomice de pe și în jurul arterei carotide sunt manipulate minim pentru a reduce inflamația post-operatorie. Bifurcația arterei carotide este suspendată. Pentru a induce formarea accelerată de neointima, arterele carotide interne și externe sunt pregătite pentru interceptarea fluxului și refuzul ulterior frecvent al arterei carotide. Pe scurt, metoda poate fi învățată de personalul cu o experiență minimă în chirurgia animalelor.

Protocol

Experimentele prezentate în această lucrare sunt efectuate în conformitate cu legislația germană și cu liniile directoare europene de îngrijire a animalelor. Animalele sunt ținute în instalația pentru animale a Institutului pentru Știința Animalelor de Laborator, Clinica Universitară Aachen, sub îndrumarea Prof. Dr. R. Tolba și Dr. A. Teubner (ofițer pentru bunăstarea animalelor) a crescut.

Păstrați șoarecii într-o unitate de îngrijire specializată pentru a asigura un acces adecvat la alimente și un control și tratament veterinar specializat. Dacă animalele sunt mutate sau cumpărate de o terță parte, vă rugăm să asigurați o perioadă de adăpostire de o săptămână înainte de a parcurge procedura.

6 - 8 săptămâni, hrană 18 - 20 g, femelă (opțională) șoareci ApoE -/- cu dietă aterogenă (21% grăsimi, 0,15% colesterol, 19,5% cazeină, Wt/Wt) cu o săptămână înainte operație și continuați dieta până când se face analiza aterosclerotică a plăcii.

3. Pregătirea chirurgicală

Îndepărtați retractoarele și readuceți stratul muscular și cele două corpuri de grăsime în poziția fiziologică.
Închideți pielea cu trei suturi separate 0/6 dacă sunt necesare măsurători ecocardiografice. Dacă imaginea nu este necesară, utilizați cleme metalice pentru a închide pielea.
Așezați mouse-ul sub lumina infraroșie din partea stângă până se trezește. Nu lăsați un animal nesupravegheat sau împreună cu alte animale până nu este complet recuperat.
Evidențiați mouse-ul pentru identificarea viitoare cu sistemul local. Întrebați ofițerul pentru bunăstarea animalelor la unitatea locală.

6. Analiza plăcii aterosclerotice

Rezultate reprezentative

Procedura de inducere a plăcii aterosclerotice durează 15-20 de minute și prezintă o rată minimă a mortalității, în principal datorită sângerării care apare în timpul procedurii. După operație, șoarecii se recuperează de la anestezie în 20-25 de minute. Nu s-au observat deficiențe fizice, cum ar fi paralizia sau tulburările de hrănire, după operație.

Leziunea firului induce deendotelializarea, care imită leziunile vaselor după udarea cu balon sau implantarea stentului. Imediat după leziune, peretele vascular denudat va fi acoperit cu un strat de trombocite care mediază și favorizează aderența monocitelor 12. Celulele musculare netede activate din mass-media se multiplică și migrează către spațiile intime care formează neointima. Alți precursori ai celulelor musculare netede migrează din sânge (aproximativ 40%) și contribuie la creșterea neointimală. Formarea plăcii se încheie după re-endotelizare completă, de obicei la 4 săptămâni după rănirea firului.

Formarea neointima poate fi evaluată cu colorarea Movat. Dimensiunea plăcii este calculată pentru fiecare film folosind software, ca în Figura 2Bafișate. Dimensiunea totală a plăcii (artera carotidă stângă) poate varia între 70.000 și 100.000 m2, în timp ce dimensiunea vasului de control (artera carotidă dreaptă) poate varia între 7.000 și 8.000 m2. Aceste valori depind în mare măsură de chirurg. Prin urmare, vă recomandăm cu tărie să folosiți același chirurg pentru același studiu pe parcursul experimentelor.

Placa dezvoltată seamănă cu restenoza stent, care constă în principal din celule musculare netede replicate și migrate din medii. în stent Compoziția celulară determinată prin colorare imunologică arată că conținutul celulelor musculare netede este în jur de 30-40%, în timp ce macrofagele se găsesc în 15-25% din neointima vasului rănit. Reendotelializarea poate fi măsurată după colorarea unui marker endotelial și calculată ca procentul circumferinței colorate pe întreaga circumferință a lumenului. De regulă, re-endotelizarea ajunge la 80 - 90% după 3 săptămâni și ar trebui să fie aproape completă după 4 săptămâni (Figura 2C). Pentru a urmări creșterea plăcii pe măsură ce se dezvoltă, aceeași analiză poate fi repetată pentru fiecare moment în timpul rănirii firului, în funcție de interesul și subiectul studiat (vezi tabelul 1).

ilustrația 1. Reprezentarea schematică a procedurii operative. (A) Poziționarea mesei de operare în raport cu operatorul în timpul procedurii de vătămare a firului(B) Vedere mărită a arterei carotide comune și a ramurilor acesteia, vizualizate la microscop la 10X(C) apare.D) Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 2. Analiza plăcii de restenoză. (A) Reprezentarea schematică a analizei plăcii în artera carotidă comună, la 4 săptămâni după inducerea leziunii firului(B) Formarea Neointima la 4 săptămâni după leziunea firului și o reprezentare schematică a celor mai importanți parametri utilizați pentru analiză. Intima (zona verde) este diferența dintre lumen (roșu) și lamina internă (linia verde). Media (zona galbenă) este diferența dintre lamina externă (linia galbenă) și interna (linia verde). Bară de scară 100 m(C) Imagini reprezentative ale colorării celor mai importante tipuri de celule implicate în formarea neointima. Celulele musculare netede (actina musculara neteda - rosie, bara de scara 100 m), macrofage (Mac 2 verde, bara de scara 100 m) si celule endoteliale (CD31 - rosu, sageti, bara de scara 50 m). Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Discuţie

În această postare, oferim sfaturi utile pentru efectuarea procedurii de vătămare a firelor chiar și de către angajații cu o experiență minimă în chirurgia animalelor. Există două etape critice în efectuarea acestei proceduri: incizarea arterei carotide externe și introducerea firului. Incizia în artera carotidă externă trebuie făcută cât mai departe posibil de bifurcație pentru a asigura suficient material rezidual (Figura 1C). Incizia nu trebuie să fie prea mare, deoarece există riscul tăierii întregului vas. Al doilea pas critic este riscul ridicat de sângerare în timpul arteriotomiei și inserarea firului de ghidare dacă fluxul sanguin nu este controlat eficient. În plus, dacă firul de ghidare este introdus necorespunzător în vasul lumen, nu poate apărea denudarea endotelială sau ruptura arterială. Pentru a evita acest lucru, suprafața firului de ghidare trebuie lustruită cu atenție înainte de operare.

Pentru a optimiza protocolul, poziția mesei de operație cu capul mouse-ului în direcția chirurgului asigură o mai bună vizibilitate, accesibilitate și control pentru o manipulare corectă a firului de ghidare. În plus, pentru a crește reproductibilitatea, utilizați același fir de ghidare în toate studiile. Deoarece dimensiunea firului nu se modifică, este important să se țină cont și să se elimine toate diferențele posibile dintre șoareci utilizând același sex, vârstă și greutate pentru toți șoarecii incluși într-un studiu. După aceea, colorarea Evans-Blue îl va ajuta pe chirurg să determine eficiența denudării. Disponibilitatea echipamentelor adecvate este o condiție prealabilă pentru succesul procedurii. Un stereo microscop de 10x este esențial pentru a efectua această procedură. Pregătirea corectă a firului de ghidare (de ex. Lustruire) este crucială. Prin urmare, recomandăm cu tărie ca pregătirea firului să fie efectuată de personal tehnic specializat, dacă este disponibil.

Acest jurnal are mulți pași de depanare. Dacă incizați artera carotidă externă lângă bifurcație, legați cu grijă exteriorele din apropierea bifurcației, astfel încât să nu apară sângerări. Artera carotidă externă nu poate fi văzută la tăiere. Prin urmare, luați în considerare bifurcația la nivelul suturii de mătase. Adunați secțiuni atunci când cusătura de mătase dispare. Dacă incizia în artera carotidă externă este prea mare și vasul este rupt, asigurați-vă că fluxul sanguin către carotida comună și artera carotidă internă este întrerupt în mod eficient și încercați să găsiți deschiderea vasului cu forceps. După inserarea și denudarea firului de ghidare, legați vasul lângă bifurcație. În timp ce tăiați, începeți să colectați când mătasea începe să dispară din cusătură. Dacă apare o ruptură arterială în timpul denudării cu firul de ghidare, verificați la microscop dacă firul de ghidare este lustruit corespunzător.

În ciuda similitudinii modelului de leziune prin cablu cu situațiile clinice, multe grupuri se concentrează asupra aterosclerozei indigene la șoareci sau aleg induceri invazive de ateroscleroză, cum ar fi angioplastia cu balon la șobolani sau iepuri, din cauza lipsei de personal instruit capabil să efectueze operațiuni la scară mică pe animale. În ciuda avantajelor utilizării iepurilor/șobolanilor, de ex. De exemplu, fără echipament miniaturizat, nici modelele de șobolani și iepuri nu oferă o mare varietate de tulpini knock-out diferite pentru studierea mecanismelor moleculare implicate în creșterea neointimală și tromboza in-stent.

Denudarea se efectuează pe peretele arterial normal, deși cu fundal aterosclerotic. Prin urmare, formarea neointima va fi moderată în comparație cu situația clinică. Numărul mare de modele preclinice arată că niciunul dintre modele nu îndeplinește toate criteriile necesare pentru a descoperi totalitatea mecanismelor celulare și moleculare care duc la fiziopatologie la om (vezi masa 2).

După finalizarea procedurii de leziune a firelor, pot fi efectuate alte analize biologice și moleculare pentru a identifica celulele, proteinele, mARN-urile, microARN-urile, genele sau alți biomarkeri care pot fi folosiți ca ținte terapeutice pentru a dezvolta noi strategii de tratament pentru ateroscleroză și în special pentru formarea neointima după leziuni vasculare. . Dacă este disponibilă, creșterea plăcii poate fi monitorizată cu ultrasunete de înaltă frecvență sau alte tehnici imagistice de înaltă rezoluție. În plus, stăpânirea acestei tehnici ar permite operatorului să adapteze protocolul la alte modele invazive de inducere a aterosclerozei, cum ar fi: B. Plasarea gulerului, ligatura parțială sau chiar implantarea stentului.