Influența stresului prenatal asupra mielinizării și formării rețelei neuronale
1 Influența stresului prenatal asupra mielinizării și formării rețelei neuronale în creierul ovinului fetal Disertație pentru obținerea diplomei academice doctor medicinae (Dr. med) înaintată Consiliului Facultății de Medicină a Universității Friedrich Schiller Jena de Julia Quendt născută la 05. Septembrie 1987 la Gotha
2 recenzori: 1. Prof. Dr. med. Matthias Schwab/Jena 2. Prof. Dr. med. Richard Berger/Neuwied 3. PD Dr. med. Ziua Apărării Publice Bernd Romeike/Jena:
3 Cuprins Cuprins LISTA ABREVIERILOR I 1 REZUMAT 1 2 INTRODUCERE Semnificația clinică a stresului prenatal pentru făt Dezvoltarea creierului fetal Dezvoltarea creierului embrionar Proliferarea și migrația celulară Diferențierea neuronală și glială Mielinizarea cerebrală Structura și compoziția biochimică a învelișului de mielină Funcția și importanța învelișului de mielină Mielinizarea Efectele stresului prenatal asupra dezvoltării creierului fetal Efectele cerebrale ale stresului matern Efectele cerebrale ale terapiei prenatale cu glucocorticoizi Reglarea axei stresului Efectele stresului matern și terapia prenatală cu glucocorticoizi asupra dezvoltării axului stresului Mecanisme ale efectelor stresului prenatal Transferul stresului matern la făt de glucocorticoizi Stresul prenatal și hormonii de creștere Obiectivul tezei 22
4 Cuprins 3 MATERIAL ȘI METODE Experimental Protocol experimental Extracția creierelor fetale și prepararea specimenelor Colorare histochimică și imunohistochimică Prezentare generală colorare cu hematoxilină-eozină Impregnare de argint conform Bielschowsky Detecție imunohistochimică a MBP Evaluare microscopică ușoară și pe PC evaluare a greutății corporale și a rezultatelor Evaluări statistice 39 stres prenatal efectele cerebrale ale stresului prenatal formarea proceselor neuronale în substanța albă substanță albă subcorticală corpus calos substanță albă profundă corona radiata capsulă interna mielinizarea proceselor neuronale în substanța albă substanță albă subcorticală corpus calos materie albă profundă Hipocamp (regiunea CA3) 64
5 Cuprins 5 DISCUȚIE Discuție despre metode model animal Model de stres Histologie Analiza cantitativă a imaginii Discuție despre rezultate Stres prenatal și creștere fetală Efecte după stres prenatal asupra hipocampului Efecte cerebrale după stres prenatal asupra rețelei neuronale Efecte cerebrale după stres prenatal asupra mielinizării 82 6 CONCLUZII 84 7 LITERALE 86 8 ANEXĂ Mulțumiri Declarație cu privire la onoare 103
6 Listă de abrevieri Listă de abrevieri ABC ACTH ADHD AK AP AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN ax 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidin-Biotin-Complex Hormon adrenocorticotropic Deficiență de atenție/hiperactivitate tampon de lucru Anticorp tampon de lucru + tampon de lucru Triton-X-100 + Triton + Ser Aqua distillata (apă distilată) arginină-vasopresină betametazonă 2-3 -Nucleotidă ciclică 3-fosfohidrolază (placentară) hormon de eliberare a corticotropinei receptor glucocorticoid gestație zi (zile) hematoxilină-eozină hipotalamică-hipofizară axa a XI-a Hidroxisteroid dehidrogenază tip 2 Insulină asemănătoare factorului de creștere Glicoproteină asociată cu mielina Proteină de bază mielină Mielină/oligodendrocit glicoproteină Receptor mineralocorticoid Valoare medie Oligodendrocit proteină mielină tampon fosfat Proteină proteolipidică Mișcarea rapidă a ochilor Temperatura camerei Eroarea standard a valorii medii
18 2 Inducerea leucomalaciei perventriculare (leziuni ale substanței albe în timpul nașterii premature) în jurul timpului 0,65 de gestație (corespunzător săptămânii gestaționale la fătul uman), un grad ridicat de comparabilitate a dezvoltării creierului între ovine fetale și oameni. Acest lucru a fost susținut de faptul că în această fereastră de timp începe maturarea oligodendrocitelor din creierul fetal al oilor și, în același timp, se poate observa un risc ridicat de afectare a substanței albe imature, periventriculare, la sugarii prematuri (Back și colab. 2006, 2001) . La momentul nașterii, creierul persoanei create prezintă un grad de maturitate ceva mai mare decât cel al oamenilor (McIntosh și colab. 1979, Astrom 1967). Acest lucru ar putea sugera că mintea creativă se maturizează mai repede în ultimul trimestru. Al 12-lea
23 2 Introducere răspuns fiziologic coordonat la diferite concentrații de cortizol (capitolul 2.4.2). Fig.2.3: Axa hipotalamus-hipofizo-suprarenală și căi de feedback negativ. Hormonul de eliberare a corticotropinei (CRH), vasopresina argininei (AVP), proopiomelanocortina (POMC), hormonul adrenocorticotropic (ACTH), nucleul paraventricular (NPV). Modificat din Metthews
30 2 Introducere arată un curs temporal similar al dezvoltării creierului cu oamenii, chiar dacă se maturizează puțin mai repede. În general, au fost evaluate creierele a 45 de lucrători care au fost stresați cronic între gestația 0,20-0,66 (GT) prin izolarea de 180 de minute în două zile pe săptămână. Deoarece oile sunt animale de turmă, izolarea este un factor de stres major pentru această specie. Pentru a arăta posibilele efecte de durată, creierele au fost evaluate la 0,73 (110 GT, durata gestației 150 zile) și 0,86 de gestație (130th GT). Rezultatele sunt menite să ajute la clarificarea efectelor stresului prenatal asupra funcției creierului în viața ulterioară. 24
32 3 Materiale și metode Izolate la urechea altor animale, astfel încât la sfârșitul protocolului fiecare animal a fost expus izolării individuale de 20 de ori. Deoarece oile sunt animale de turmă, ele sunt deosebit de sensibile la acest factor de stres. Măsurătorile nivelului de cortizol înainte și în timpul izolării au confirmat acest efect (Rakers și colab. 2012). Grup de stres Grup de control Sincronizarea ciclului estru și împerecherea programată ÎN COMPARAȚIE Creșterea animalelor adecvate la cioban Transportul animalelor însărcinate la un laborator de test Stres prin izolare de 2 ori pe săptămână timp de 3 ore Instrumentație cronică Obținerea creierelor fetale - Grupa 1 Obținerea creierelor fetale - Grupa 2 Data limită naturală Fig .3.1: Protocol experimental Între 100 și 110 GT, făturile au fost instrumentate folosind catetere, care au fost utilizate pentru a verifica răspunsurile la stres intrauterin (ACTH și eliberarea de cortizol). Evaluarea lor nu face obiectul acestei lucrări (vezi Rakers 2012). După finalizarea experimentelor și dezvoltarea operativă a făturilor, au fost determinate greutățile corpului și creierului lor. Aceste măsurători au fost luate pe 26
36 3 Material și metode ale unei serii alcoolice ascendente deshidratate și închise cu un suport de montare Neo-Mount (MERCK GmbH, Darmstadt, Germania). Protocolul detaliat al colorării este prezentat în Tabelul 3.2. Depilare medie: 2x Neoclear 2x izopropanol 100% 1x izopropanol 80% 1x izopropanol 50% apă distilată. Impregnare cu argint: AgNO 3 20% 2x aqua dest. Soluție amoniacală de azotat de argint apă distilată + nh 3 (4: 1) Tiosulfat de apă de la robinet 5% apă distilată. Deshidratare: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x Includere balsam neoclear cu timp de entellan [min]/temp. [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90///RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Tabelul 3.2: Protocol pentru impregnarea argintului conform Bielschowsky. RT temperatura camerei. Soluțiile se prepară după cum urmează: 20% soluție de azotat de argint (AgNO3): 100 ml apă distilată g azotat de argint 5% tiosulfat de sodiu (Na 2 S 2 O 3): 100 ml apă distilată. + 5 g tiosulfat de sodiu pentru soluția de dezvoltare: 25 ml apă distilată, mg acid citric (Fluka Chemie, Buchs, Germania) + 5 ml 36% formalină (Carl ROTH GmbH, Karlsruhe, Germania) + 8 µl acid azotic concentrat HNO 3 (Fluka Chemie, Buchs, Germania). 30
40 3 Material și metode 2xAP + T Complex ABC: soluție AP + T + soluție A + soluție B + T 2x apă distilată PBS. 3'3-diaminobenzidină (DAB) 2x dest. Acv. Deshidratare: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x Neoclear 100% incluziune balsamică cu Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 20µl fiecare din soluția A și B în 1 ml AP + T 1Set (H2O2 + DAB) pentru 5 ml apă distilată, filtru cu filtru Millipore Tabel 3.3: Protocol pentru detectarea imunohistiochimică a MBP. Soluțiile se prepară după cum urmează: Citrat tampon: 1 litru apă distilată. + 2,94 g citrat de sodiu (Fluka Chemie, Buchs, Germania), pH 6,0. PBS: 1 litru de apă distilată. + 1 g tampon de lucru D-PBS: 500 ml PBS + 2,5 g albumină serică bovină (albumină din ser bovin, minim 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Germania) µl TWEEN 20 (polioxietilen sorbitan monolaurat) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Germania) ph 7.5. Soluție DAB (substrat Sigma Fast DAB): 2 tablete (peroxid de hidrogen de uree și 3,3-diaminobenzidină) în 5 ml apă distilată. rotiți până când comprimatele finite se dizolvă complet. 34
42 3 Material și metode Fig.3.3: Colorarea generală a H&E modificată, conform The Sheep Brain Atlas, Michigan State Unversity Brain Biodiversity Bank, National Science Foundation Stânga: Substanță albă subcorticală în cortexul frontal: lângă cortex [1] și la distanță de cortex [2]; Corpus calos [3]; Corona radiata [4]; Capsulă internă [5]; SV: ventricul lateral. Dreapta: regiunea CA3 în hipocamp: secțiune ventrală [1], secțiune dorsală [2] 36
43 3 Material și metode După stocarea digitală, înregistrările au fost evaluate într-un program de procesare a imaginilor (Scion Image 1.62 NIH, SUA). În primul rând, imaginile color au fost convertite în imagini alb-negru cu 256 de niveluri de gri. Zona marcajului pozitiv într-o secțiune reprezentativă a fost determinată prin intermediul analizei imaginii. Aria imunomarcării/impregnării cu argint reflectă distribuția imunohistochimică a antigenului/densității proceselor celulare. În comparație cu imaginea microscopică, o valoare prag superioară și inferioară au fost stabilite sub control vizual. Aceste valori prag formează un interval pentru o reprezentare selectivă a imunoreactivității MBP pozitive sau a fibrelor nervoase de culoare argintie. (vezi Fig. 3.4, marcaj roșu). Fig.3.4: Analiza imaginii cu ajutorul valorilor de gri A: Imagine microscopică: Procese neuronale în substanța albă subcorticală a cortexului frontal îndepărtat de cortex. 37
44 3 Material și metode B: Marcarea extensiilor celulelor colorate în imaginea în tonuri de gri Comparativ cu imaginea microscopică, o imagine gri este definită în imaginea în tonuri de gri (marcată cu roșu în imagine) care corespunde semnalului pozitiv al impregnării de argint. Această zonă este măsurată de programul de analiză a imaginii. 38
61 Zona MBP- IR [10-3 mm²] 4 rezultate Substanță albă subcorticală - lângă cortex 1,00 0,50 $$$ $$$ (n = 9) (n = 11) Stresul de control (n = 15) (n = 10) 0, vârsta gestațională [d] Fig.4.18: Efectele vârstei și stresului asupra mielinizării proceselor neuronale în substanța albă subcorticală a cortexului frontal lângă cortex. MW ± SEM. $$$ p 62 4 Rezultate Corpurile celulare și procesele nervoase din substanța albă subcorticală îndepărtată de cortex sunt clar marcate ca MBP-pozitive (Fig. 4.19). Fig.4.19: Microfotografii ale proceselor neuronale în substanța albă subcorticală a cortexului frontal îndepărtat de cortex. Detectarea imunohistochimică a MBP. Procesul neuronal corpul celulei A: animal de control în ziua de gestație 110 B: animal de stres în ziua de gestație 110 C: animal de control în ziua de gestație 130 D: animal de stres în ziua de gestație 130
72 Suprafața de impregnare a argintului [10-3 mm²] 4 rezultate 1,50 Hipocampus- Regiunea CA 3, secțiunea ventrală 1,00 USD 0,50 (n = 9) (n = 7) (n = 6) * (n = 8 ) Controlul stresului 0, vârsta gestațională [d] Fig.4.29: Efectele vârstei și stresului asupra rețelei neuronale în regiunea CA3 a hipocampului, secțiunea ventrală. MW ± SEM; * p 73 4 rezultate Fig. 4.30: Microfotografii ale structurii neuronale din regiunea hipocampului CA3, secțiunea dorsală. Impregnarea cu argint. Celula cu nucleu Proces neuronal A: animal de control în ziua de gestație 110 B: animal de stres în ziua de gestație 110 C: animal de control în ziua 130 de gestație D: animal de stres în ziua de gestație 130