Izolarea și diferențierea celulelor stem derivate din adipoză de adipos subcutanat porcin

Introducere

Obezitatea, care reprezintă aproximativ 30% din populația SUA, cu un indice de masă corporală peste 30, a apărut ca un fenomen mondial 1. Obezitatea 2-4 tinde să conducă la complicații legate de boli cardiovasculare, diabet de tip 2 și cancer. Prin urmare, obezitatea poate fi tratată este o prioritate importantă. Obezitatea se manifestă prin extinderea masivă a țesutului adipos și este atribuită supraalimentării și stilurilor de viață sedentare din societatea modernă. Astfel, deținerea reglării transcripționale a descifrării adipogenezei și lipogenezei ar putea promite 5 tratarea obezității sau diabetului.

3T3-L1, 3T3-F442A și alte linii celulare adipogene de șoarece au fost aplicate pentru a studia adipogeneza sau lipogeneza în timpul dezvoltării țesutului adipos. Cu toate acestea, există unele abateri în mecanismele de reglare între liniile celulare in vitro și in vivo de animale 6. Celulele stem derivate din țesutul adipos primar (ADSC) din fracțiunea celulară vasculară a stromei pot fi izolate direct din țesutul adipos alb și induse să se diferențieze. Diferențierea ADSC în adipocite recapitulează cel mai probabil procesul de adipogeneză și lipogeneză în dezvoltarea țesutului adipos in vivo 7.

Porcii sunt un model animal adecvat pentru a studia adipogeneza și lipogeneza în dezvoltarea țesutului adipos. Studiile noastre anterioare porcine 8-10 arată că expresia sterolului - factorul de transcripție obligatoriu al elementului de reglare 1c (SREBP1c), un factor important de transcripție cunoscut pentru modularea transcripției lipogenice a acidului gras sintază, care este inhibat de acizii grași polinesaturați (PUFA) din ficatul de porc și țesutul adipos . Expresia porcinei SREBP1c scăzută de PUFA in vivo și in vitro este similară cu alte specii, cum ar fi omul și șoarecele 11-13. Aceste studii in vitro porcine se află în principal în adipocite diferențiate derivate din ADSC porcine (pADSC). Prin urmare, această cultură de celule primare pADSC poate fi utilizată ca un sistem celular fiabil pentru a servi ca dezvoltare a țesutului adipos sau pentru a studia alte aplicații de celule stem.

Protocol

NOTĂ: Această metodă a fost fabricată și utilizată în cercetările raportate anterior 14-17 din acest laborator; de-a lungul timpului metodologia s-a schimbat. Procedura actuală a fost făcută de la un purcel (7 până la 9 zile) cu însămânțare pe plăci de cultură tisulară cu 6 godeuri cu o medie de 60 g țesut adipos subcutanat de porc. Toate procedurile au fost efectuate la RT dacă nu se specifică altfel. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) de la Universitatea Națională din Taiwan.

1. Pregătiți mediul de digestie

  1. Obțineți grăsime subcutanată din gât și din spate; 40 până la 80 g per purcel (7 până la 9 zile), în funcție de mărimea porcilor. Aici utilizați 60 g de țesut adipos subcutanat obținut de la un porc.
  2. Pregătiți mediul de digestie: cântăriți pulberea de colagenază II cu un total de 54.000 de unități și dizolvați-o în 90 ml mediu Eagle modificat Dulbecco (DMEM, 60 g grăsime) într-o sticlă serologică de 100 ml (900 unități de colagenază/1,5 ml DMEM/g grăsime ).
  3. Se învârte ușor pentru sterilizare pentru a se dizolva cel puțin 15 minute și apoi trece mediul de digestie printr-un filtru de 0,22 µm pentru a trece mediul de digestie pe o masă de agitare (100 rpm). A se păstra la 4 ° C înainte de utilizare.

2. Se disectează țesutul adipos subcutanat de la porc

stem
Figura 1. O mașină de tăiat personalizată pentru Izolarea pADSC utilizat. Țesut adipos disecat din coapsă de porc țesut adipos subcutanat compus din stratul de grăsime cu straturile de piele atașate. Este necesară o mașină de tăiat pentru a tăia stratul de grăsime de aproximativ 1 mm grosime, evitând supra-tăierea în straturile de piele. De la stânga la dreapta: suport pentru șaibă, tampon pentru tăietor, lamă de tăiat din oțel carbon și șuruburi. Cuțit pentru feliat introdus între suportul pentru felii și tamponul pentru feliat atunci când este asamblat. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

3. Colectarea pADSC din fracția stroma-vasculară

  1. Treceți mediul de digestie care conține țesutul gras digerat printr-un singur strat de șifon într-un balon Erlenmeyer de 250 ml sterilizat sau într-un balon serologic de 250 ml. Folosiți o pereche de clești pentru a apăsa centrul șifonului pentru a ghida și a susține trecerea digestului.
  2. Scurgeți și răsuciți sifonul cu clești pentru a finaliza trecerea.
  3. Distribuiți mediul de digestie în patru tuburi de centrifugă conice de 50 ml (

4. Identificarea markerilor de suprafață a celulelor stem din pADSC prin citometrie în flux

5. Diferențierea pADSC în adipocite, osteocite și condrocite

6. Colorarea adipocitelor diferențiate, osteocitelor și condrocitelor

Rezultate reprezentative

PADSC derivat din țesutul adipos subcutanat dorsal de porc au fost semănate pe plăcile de cultură sau vase și plasate în 2. Morfologia pADSC din fracția vasculară a stromei se arată că este similară cu ADSC de la șoarece sau de la om. Douăzeci și patru de ore după însămânțare, pADSC subconfluent a respectat și are o morfologie extinsă asemănătoare fibroblastelor (2A). PADSC se va confluenta în decurs de 72 de ore și este pregătit pentru adipocite sau altă diferențiere de tip mezenchimal (2 B). pADSC prezintă un potențial adipogen puternic după inducția chimică și adipocitele mature pot diferi după 9 zile, cu mai mult de 90% din pADSC care prezintă diferențieri adipogene (Figura 2C) să fie urmărit.

Pentru a aborda proprietățile pADSC dezvăluite în acest protocol, markerii de suprafață ai pADSC au fost evaluați utilizând analiza de citometrie în flux. Ca în 3 afișat este , Markerii de suprafață pentru celulele stem mezenchimale incluzând CD29, CD44, CD90 și MHC I (sau HLA I) au fost foarte exprimați. Markerii de suprafață negativi, cum ar fi CD4a, CD31, CD45 și MHC II (sau HLA II), au fost greu de detectat în pADSC derivat în protocol (Figura 3). Aceste rezultate indică faptul că aceste pADSC prezintă proprietăți ale celulelor stem de tip mezenchimal fără contaminare semnificativă a celulelor stem endoteliale sau hematopoietice, inclusiv progenitori mieloizi sau limfatici.

Pentru a se asigura că pADSC reprezintă celule stem mezenchimale, multipotența pADSC a fost examinată prin diferențiere în adipocite, osteocite și condrocite. Aceste adipocite, osteocite și condrocite au fost colorate de coloranți specifici, roșu ulei O, roșu alizarină S și, respectiv, albastru Toluidină O. (Figura 4). Aceste date indică faptul că acest protocol a produs pADSC-uri care au păstrat tipotența mu cu proprietăți complete similare precursorilor de tip mezenchimal.

derivate
Figura 2. Morfologia pADSC din regiunea coapsei de porc. (A) PADSC subconfluent s-a blocat și s-a răspândit după însămânțarea de 24 de ore pe o placă de cultură cu 6 godeuri. (B) După însămânțarea de 72 de ore, pADSC a devenit confluent pe o placă de cultură cu 6 godeuri. (C) Adipocitele mature au fost observate după 9 zile de diferențiere adipogenă de către pADSC. Imaginile luate la o mărire de 100x au fost microscopie cu contrast de fază. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

diferențierea
Figura 3. Identificarea celulei stemMarkeri de suprafață pentru pADSC. 1 x 105 de pADSC au fost implementate cu anticorpi specifici și analizați pentru markerii celulelor stem prin analiza citometrică în flux. Numerele indică procentul de celule colorate din populație (roșu) în comparație cu martorul ne colorat. Axa x reprezintă intensitatea relativă a fluorescenței. Axa y reprezintă populația de celule. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

izolarea
Figura 4. Diferențierea pADSC multipotent. Multipotența pADSC a fost determinată prin diferențierea pADSC în (A) Adipocite determinate, (B) Osteocite (C) Condrocite și colorate de coloranți reprezentativi, roșu ulei O, roșu alizarină S și, respectiv, albastru Toluidină O. Imaginile erau la (A) luat 100 x (B) 200 x și (C) Mărit 100X folosind microscopie cu contrast de fază. Faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

Discuţie

Aici vă prezentăm un sistem celular fiabil pentru a studia dezvoltarea țesutului adipos în cultura celulară primară a pADSC. Comparativ cu alte linii celulare imortalizate, această metodă oferă o modalitate convenabilă de a izola cantități mari de celule stem mezenchimale adulte de înaltă calitate, care pot fi utilizate pentru studierea proceselor de diferențiere a adipocitelor sau a altor linii mezenchimale legate de dezvoltarea animalelor in vivo. Pasul critic în acest protocol modificat este că putem obține pADSC cu un purcel de 7 până la 9 zile, deoarece este ușor de manipulat purceii mici comparativ cu porcii mai în vârstă și similar cu alte specii 19,20 care Randamentul și multipotența pADSC scade atunci când porcii au vârsta de 21 de ani.

Sursele potențiale de celule stem includ celule stem embrionare (ESC), celule stem pluripotente induse (iPS) și celule stem postnatale adulte. Limitarea ADSC, clasificată ca celule stem multipotente adulte, este că multipotența celulelor stem adulte în diferențieri de linii divergente este relativ limitată în comparație cu ESC sau iPSC. Cu toate acestea, întrebările etice privind derivarea ESC și proprietățile oncogene ale iPS limitează utilizarea ESC și iPSC 22,23. Din această cauză, numeroși cercetători s-au concentrat asupra celulelor stem adulte cu eforturi de îmbunătățire a pluripotenței. Cea mai frecventă cauză a celulelor stem mezenchimale adulte (MSC) care a fost mult timp studiată este celulele stem mezenchimale derivate din măduva osoasă 24. Cu toate acestea, recoltarea măduvei osoase este considerată o procedură relativ dureroasă. O altă problemă este că randamentul celulelor stem din măduva osoasă este finit. Aspiratele de măduvă osoasă au în medie 6 × 106 celule nucleate pe ml, iar MSC reprezintă doar 0,001-0,01% din toate celulele nucleate. După luarea în considerare a acestor dezavantaje, ADSC este sugerat ca o sursă mai puțin intruzivă pentru a obține 25,26 celule stem multipotente.

Mulțumiri

Autorii ar dori să-și exprime recunoștința tuturor membrilor laboratorului pentru discuțiile detaliate și suporturile tehnice din acest protocol. Cercetările efectuate în laborator au fost susținute de granturi de la Ministerul Științei și Tehnologiei (MOST 103-2314-B-002-126 și MOST 102-2313-B-002-026-MY3) și de granturi de la Aim pentru universitatea de top -Plan Supported (104R350144) Universitatea Națională, Taiwan.