Laborjournal online Journalclub - apă în cale
Karin Hollricher
Marburg: Moleculele de apă sunt cruciale pentru legăturile dintre proteine și liganzi. Acesta este motivul pentru care chimiștii și farmaciștii le analizează foarte atent.
Cristalografia neutronică, calorimetria, entalpia, entropia - acestea sunt cuvintele cheie la care cititorul articolului lui Johannes Schiebel și colegii săi de la Universitatea Philipps din Marburg sar literalmente (Nat. Commun. 9: 3559). Cuvinte care implică imediat: Aici se complică. „Articolele noastre sunt aproape întotdeauna foarte greu de citit”, spune autorul principal Gerhard Klebe, care efectuează cercetări la Institutul de chimie farmaceutică de la Universitatea din Marburg. „Dar dacă mușcați, chiar obțineți ceva din asta.” Bine, acceptăm invitația.
Klebe și colegii săi din grupul de lucru pentru proiectarea medicamentelor doresc să optimizeze ingredientele farmaceutice active - și nu doar de ieri. În cariera profesională a lui Klebe, aproape totul se învârtea în jurul educației și îmbunătățirii efectelor medicamentelor: a studiat chimia, un an la sursa de neutroni din Grenoble, postdoctorii în cristalografie, peste zece ani la BASF, din 1996 la Universitatea din Marburg și autor al manualului foarte lăudat " Proiectarea ingredientelor active ".
De asemenea, proteinele trebuie să scoată din cale moleculele de apă pentru a lega liganzii. Foto: iStock/cactuseskimo
Cea mai recentă publicație a grupului său de lucru se ocupă, de asemenea, de relațiile complexe ale legăturilor dintre proteine și liganzi, mai precis cu enzimele și inhibitorii. Experimentele sunt complicate - așa că cercetătorii au căutat o proteină „simplă”: tripsina. Această enzimă aparține clasei de serin proteaze și poate fi inhibată de N-amidinopiperidină și benzamidină.
Farmaciștii și chimiștii spun, printre altele, că apa determină dacă două molecule se potrivesc perfect ca o cheie și o încuietoare. Deoarece proteinele celulare funcționează în soluție apoasă și sunt, prin urmare, foarte hidratate, este evident intuitiv că un ligand care dorește să se lege trebuie mai întâi să creeze spațiu și să mute câteva molecule de apă. Cu toate acestea, această teză nu a fost încă dovedită pe deplin experimental. Cel puțin confirmarea a fost oferită de enzima trombină, de asemenea o serină protează care este importantă pentru coagularea sângelui. După ce moleculele de apă individuale au fost îndepărtate din buzunarul de legare al trombinei, comportamentul de legare a inhibitorilor s-a îmbunătățit dramatic. Această descoperire a dus la dezvoltarea unor anticoagulante mai eficiente.
Atata timp cat nu stim unde sunt moleculele de apa si cum se schimba pozitia lor, cunostintele noastre despre interactiunea dintre proteine si partenerii lor de legare ramane incompleta, explica Klebe. „A trebuit să folosim metodele până la limită pentru a descrie comportamentul moleculelor de apă pe tripsină.” Și cu aceasta, echipa Marburg și colegii din Genova, Jülich, Hamburg și München au umplut 15 pagini - plus un supliment!
Studiul de legare a început cu analize termodinamice. Chiar dacă de mult timp se știe că factorii termodinamici au o influență decisivă asupra comportamentului de legare, au fost doar puțin studiați. Prea complicat. Formula utilizată pentru a descrie procesul termodinamic atunci când două molecule se leagă, pare foarte simplă: ∆G ° = ∆H ° - T∆S °.
∆G, diferența de energie Gibbs între starea liberă și legată, determină reacția. Această diferență este alcătuită din diferența dintre entalpia H ° și entropia S °. Entalpia este toate energiile conținute în sistem la presiune constantă. Entropia descrie starea de ordine într-un sistem. Conform celei de-a doua legi a termodinamicii, o reacție are loc în mod voluntar când ∆S tinde spre zero, adică G devine mai mic datorită reacției.
Ce înseamnă acest lucru pentru proteine și liganzi? O legătură puternică este întotdeauna asociată cu o mică energie Gibbs, diferența ∆G dintre moleculele libere și cele legate este atunci clar negativă. Această diferență de energie poate fi dovedită ca transfer de căldură folosind calorimetrie de titrare izotermă (ITC). Partenerii de legare sunt titrați la o temperatură constantă și cantitatea de căldură generată la formarea complexului este măsurată cu un calorimetru. Astăzi calorimetrele sunt atât de sensibile încât pot fi utilizate pentru a detecta o cantitate de căldură în ordinea mărimii microcaloriilor. Măsurarea căldurii este un experiment simplu, iar software-ul dispozitivului furnizează în mod fiabil ∆H °, constanta de legare și, de asemenea, energia Gibbs. Dar asta nu este tot. Piulița dură de spart este evaluarea: ce atomi sau legături aduc contribuțiile la care se schimbă energia?
Dacă un ligand deplasează o moleculă de apă puternic fixată și apar noi interacțiuni hidrofobe, câștigul în entropie este mai mare decât dacă o moleculă de apă mai puțin legată trebuie să cedeze. „Din păcate, totuși, entalpia și entropia lucrează adesea una împotriva celeilalte”, explică Klebe. Pentru a optimiza o legătură, nu este, prin urmare, suficient să modificați un ligand în așa fel încât să scadă doar entropia. „Trebuie să luăm în considerare schimbarea diferențelor dintre entropie și entalpie”.
În Marburg, Tobias Wulsdorf, un chimist cu abilități în informatică, a scăpat cu adevărat abur în sistemul de formulare termodinamice al legăturii inhibitorului de tripsină. El a arătat că legarea mai puternică a benzamidinei în comparație cu inhibitorul piperidinei este avantajoasă din punct de vedere entalpic.
Pentru a ilustra rolul moleculelor de apă, autorii au determinat structurile cristaline. De obicei, pentru aceasta se folosesc raze X. Cu toate acestea, potrivit lui Klebe, acest lucru nu este suficient de sensibil pentru a localiza cu precizie moleculele de apă. De aceea au folosit radiații de la sursa de neutroni la Universitatea Tehnică din München. Pentru cristalografia cu neutroni sunt necesare cristale proteice foarte mari. Realizarea acestora este o artă. Cu „degetele aurii”, entuziasmează Klebe, primul autor și apoi doctorandul Johannes Schiebel a creat cristale de tripsină - cu și fără liganzi. Klebe: „Marele lucru legat de difracția neutronică este că radiația nu distruge cristalele de proteine și măsurătorile pot fi întrerupte și apoi continuate. Am putut măsura pe un cristal săptămâni întregi - cu întreruperi - și astfel am obținut o rezoluție mai mică de 1,5 Angstrom. Acestea sunt cele mai bine rezolvate structuri de neutroni care au fost realizate până acum pe proteine de această dimensiune. "
Aflați mai multe despre noile noastre produse și comandați astăzi noul catalog 2021 la. Mai Mult
Dar asta nu este tot: chimiștii au determinat și structurile cristaline cu raze X. Marea provocare a fost efectuarea măsurătorilor cu raze X, cum ar fi difracția neutronilor la temperatura camerei, astfel încât datele să poată fi comparate și combinate ulterior. Klebe: „Am reușit să calculăm o structură combinată X-N (nota editorului: X reprezintă raze X, N pentru neutroni) din datele cu raze X și neutroni și să o folosim cu datele termodinamice pentru simulări pe computer.”
Echipa a găsit nouă molecule de apă în jurul aspartatului 189 în buzunarul de legare al tripsinei. Trei sunt direct în buzunarul de legare al tripsinei, încă patru sunt mai mult sau mai puțin în spatele aspartatului și servesc drept „rezervor” dacă se pierde una dintre moleculele interioare. Ceea ce se poate întâmpla cu ușurință, deoarece moleculele interioare de apă nu sunt la fel de strâns legate cu doar două legături de hidrogen precum cele externe cu trei. Restul sunt puțin mai departe.
Cercetătorii de la Marburg au arătat că un inhibitor deplasează o moleculă de apă atunci când se leagă. Ca urmare, orientarea unei alte molecule de apă se schimbă: se apropie de tirozină 228, creând o nouă legătură de hidrogen. Ca rezultat, este mai ferm fixat și nu se mai poate roti liber, ceea ce duce la o „pedeapsă entropică”, după cum scriu autorii. Aceste și multe alte observații foarte detaliate au arătat care sunt legăturile de hidrogen și interacțiunile hidrofobe care sunt rupte prin formarea complexă și care sunt nou formate. Klebe: Credem că structurile de apă din proteină și stările de sarcină de pe aspartat sunt responsabile pentru diferitele afinități de legare ale celor doi inhibitori de tripsină.
Experiența pe care Klebe a dobândit-o de-a lungul anilor la universități și în industrie nu ar trebui transformată exclusiv în hârtie în viitor. În martie, foștii angajați Klebe au înființat compania CrystalsFirst cu sprijinul său. Scopul este de a utiliza o nouă tehnologie cunoscută sub numele de „SmartSoak” pentru a stabiliza cristalele de proteine, a determina structura lor 3D și, astfel, să treacă prin colecția de candidați la medicamente cu ajutorul unui software. „În acest fel, datele geometrice esențiale pentru cercetarea farmaceutică modernă pot fi furnizate rapid și, mai presus de toate, în mod fiabil într-un stadiu foarte timpuriu al căutării medicamentelor, iar efortul ridicat implicat în căutarea medicamentelor este redus semnificativ”, spune comunicatul de fondare al companiei. Să vedem dacă asta se împlinește.
Grupului de lucru (incomplet) al chimistului Gerhard Klebe (spate, jachetă deschisă) îi place să facă un tur de descoperire: le plac în mod deosebit cristalele - fie în peșteri, fie cu proteine. Foto: AG Klebe