Prevenirea rezistenței la leptină prin blocarea receptorilor de angiotensină II (AT 1) din cadru

1 De la Institutul de Farmacologie Experimentală și Clinică și Toxicologie de la Universitatea din Lübeck Director: Prof. Dr. med. Markus Schwaninger Prevenirea rezistenței la leptină prin blocarea receptorilor de angiotensină II (AT 1) în contextul obezității induse de dietă la șobolani Disertație inaugurală pentru obținerea unui doctorat de la Universitatea din Lübeck - De la Secția Medicină - prezentată de Margot Lau, geb. Thermann de la Lübeck Lübeck 2012

prevenirea

2 Reporter 1: Prof. Dr. rer. nat. Walter Raasch Reporter 2: Prof. Dr. med. D. Ludwig 3. Raportor: Prof. Dr. med. P. Gohlke Ziua examinării orale: Aprobat pentru tipărire: Lübeck, comitetul de doctorat al secției de medicină

3 - Pentru dragii mei părinți-

4 Cuprins Cuprins Cuprins Introducere Rezistență la insulină Obezitate Sistemul de renină-angiotensină-aldosteron (RAAS) Material și metode Protocoale de testare Testarea animalelor Examinarea sensibilității la leptină sub telmisartan Examinarea toleranței la glucoză în timpul hrănirii pe termen lung cu dietă de cafenea Pregătirea soluțiilor Soluție de insulină Soluție de leptină sau soluție de medicament Substanțe Aplicare intraperitoneală Aplicare orală Aplicare subcutanată Extracția materialului Anticoagulanți și stabilizatori Recoltarea sângelui din coadă Uciderea și îndepărtarea organelor Testele funcționale Măsurarea tensiunii arteriale pletismografice Măsurarea activității Testul de rezistență la leptină Testul de toleranță la glucoză oral

5 Cuprins Test de toleranță la insulină (ITT) Analize biochimice Radioimunoanaliză (RIA) Pregătirea hipotalamului Extracția mrna cuantificarea mrna sinteza cdna Calcule cantitative în timp real PCR Western blot și metode statistice Rezultate Stabilirea testului de rezistență la leptină Cinetica leptinei după o singură aplicare subcutanată a rezistenței la leptină Influența telmisartanului asupra sensibilității la leptină Influența tratamentului telmisartan asupra greutății corporale și aportului de energie sub Telmisartan Investigarea toleranței la glucoză în timpul hrănirii pe termen lung cu dietă de cafenea Influența dietei de cafenea asupra greutății corporale Consumul de alimente și apă sub dieta de cafenea Influența dietei de cafenea asupra greutății corporale Activitate fizică Influența dietei de cafenea asupra hemodinamicii Influența dietei de cafenea asupra parametrilor metabolici bazali Test de toleranță orală la glucoză (OGTT) Test de toleranță la insulină (ITT) Influența dietei de cafenea asupra supraviețuirii

6 Cuprins 4 Discuție Influența blocadei AT 1 cu telmisartan asupra sensibilității la leptină Aportul și consumul de energie sub CD Influența CD asupra dezvoltării rezistenței la insulină Influența CD asupra mortalității din SHR Perspectivă sumară Bibliografie Anexă Lista figurilor Lista tabelelor Substanțe și soluții achiziționate Rețete de soluții Achiziționate Kituri de testare Kituri RIA Kituri pentru determinarea expresiei genelor Consumabile Dispozitive Lista abrevierilor Mulțumiri Curriculum vitae Publicații Poster Publicații Premii și premii

22 Material și metode heim, 8 mg/kg/zi) sau apă (H2O) tratată ca martori. Toți șobolanii ar putea alege între dieta pentru cafenea și dieta standard. După o fază de familiarizare de zece zile, șobolanii au fost randomizați în patru grupuri (n = 10): SD tratată TEL/Lep (n = 10) SD tratată TEL (n = 26) SD tratată TEL/NaCl (n = 10) TEL -DS tratată (n = 6): tensiunea arterială SD tratată cu H2O (n = 20) H20/SD tratată cu Lep (n = 10) SD tratată cu H20/NaCl (n = 10) Fig. 3: Regim de tratament pentru determinarea sensibilității la leptină sub telmisartan (TEL) sau control (H 2 O) cu hrănire simultană cu dieta de la cantină. În testul final de rezistență la leptină, șobolanii Sprague-Dawley (SD) au primit fie leptină (Lep), fie ser fiziologic (NaCl) injectat subcutanat. Datorită testului complex de rezistență la leptină la sfârșitul studiului, animalele au fost livrate schimbate cu o săptămână, astfel încât doar 20 de animale au fost randomizate în cele patru grupuri (n = 5), iar protocolul de testare a putut fi efectuat în mod analog, schimbat cu o săptămână (Fig. 4)

25 Material și metode 2.2 Pregătirea soluțiilor Soluție de insulină Insulina umană (Insuman Rapid) la o doză de 40 UI/ml a fost diluată la 1:80 cu 0,9% NaCI, astfel încât 0,5 UI/ml este 0,5 UI/kg greutate corporală intraperitoneal Soluția de leptină (sisteme R&D, leptină de șobolan recombinantă, puritate> 97%) a fost dizolvată în tampon TRIS (tris (hidroximetil) aminometan) de 20 mm, pH 8 și diluat la o concentrație de 100 sau 200 ug/ml. În acest scop, a fost utilizat inițial tamponul Tris. Cantitatea corespunzătoare de Tris a fost cântărită și în apă distilată. dizolvat, tamponat la valoarea dorită a pH-ului cu NaOH 5 N și ajustat la volumul necesar cu apă distilată. umplut. Soluția finită a fost filtrată steril Soluția de telmisartan Soluția de telmisartan (Boehringer, Ingelheim) a fost alcătuită într-o concentrație de 8 mg/ml. Informațiile se aplică soluției stoc de 10 ml. Pulberea de telmisartan a fost cântărită în cantitatea adecvată și complet dizolvată în 2 ml de soluție de NaOH 0,1 N. 6 ml apă distilată. au fost adăugate prin pipetă și titrate cu HCI 0,1 N într-un interval de pH cuprins între 8,8 și 9,2. În cele din urmă, cu aqua dest. alcătuit până la 10 ml

26 Material și metode 2.3 Aplicarea medicamentelor sau substanțelor Aplicare intraperitoneală Insulina a fost administrată intraperitoneal (canulă 0,4 x 13 mm, BD Microlance) la o doză de 0,5 UI/kg. Aplicare orală Aplicarea orală a lichidelor a fost efectuată printr-un faringe, care a fost introdus în esofag după ce animalele au fost obișnuite. 50% glucoză și telmisartan într-o doză de 8 mg/kg au fost administrate pe cale orală. Aplicare subcutanată Leptina a fost injectată în doză de 100 și 200 µg/kg în țesutul adipos subcutanat medial la scapula într-un pli cutanat configurat în acest scop (canulă 0,4 x 13 mm, BD Microlance). 2.4 Extracția materialului Anticoagulanți și stabilizatori Parametrii leptină, insulină, C-peptidă, glucagon, adiponectină și corticosteron au fost determinați din plasmă în microvete acoperite cu K-EDTA (Sarstedt). Soluția de Na-EDTA cu o concentrație finală de 12,1 mm a fost adăugată la sângele sacrificat pentru a examina leptina în plasmă