Reconstrucția la scară largă a defectelor cu un nou cadru hibrid din poli

subiecte

abstract

introducere

Defectele osoase de dimensiuni critice sunt o afecțiune clinică obișnuită, cauzată în general de traume, boli osoase sau rezecția tumorii 1. Pierderea osoasă rezultată nu poate fi reparată fiziologic și sunt de obicei necesare cantități mari de regenerare osoasă 2. Grefele osoase, cum ar fi grefele automate și alogrefele, au fost utilizate pe scară largă pentru inducerea și mărirea oaselor în defectele osoase mari 3. Cu toate acestea, aceste grefe osoase au unele limitări care fac din substitutele sintetice ale grefei osoase o alternativă atractivă 4, 5 .

Rezultate

Caracterizarea cadrelor PLLA/nHA/CM-AL

Morfologia și porozitatea cadrului

Caracteristicile morfologice ale schelelor au fost vizualizate prin microscopie cu lumină și SEM așa cum se arată în FIG. Analiza secțiunii transversale a cadrelor sub microscopie cu lumină a arătat că zonele fotice și CH/nHA-AL (maro) au fost distribuite uniform în cadre (FIG. 1A). În cadrul SEM, cadrele au arătat o structură poroasă conectată omogen, cu diametre de pori de 150-250 μm. Morfologia schelelor a fost foarte diferită între cele două schele (PLLA/nHA și CM-AL), cu CH/nHA-AL parțial încorporat în schelele CM-AL (1A).

Proprietățile schelelor CM-AL care conțin diferite concentrații de CH/nHA-AL. ( A. ) Morfologia cadrelor CM-AL (0%), CM-AL (10%) și CM-AL (20%) sub microscopie cu lumină (LM) și microscopie electronică cu scanare (SEM); ( B. ) Porozitatea cadrelor CM-AL cu conținuturi diferite de CH/nHA-AL; ( C. ) Rezistența la compresiune și modulul cadrelor CM-AL cu diferite conținuturi CM-AL; ( D. ) Testarea in vitro a eliberării medicamentelor de schele CM-AL timp de până la 25 de zile folosind schele CH/nHA-AL și PLLA/nHA/AL ca martori. O săgeată neagră indică matricea PLLA/nHA în timp ce o săgeată albă indică microsferele CH/nHA-AL. * p

Degradarea in vitro a schelelor CM-AL cu conținut diferit de CH/nHA-AL în timpul observației de 12 săptămâni. ( A. ) Modificări morfologice la schelele observate în SEM; ( B. ) valoarea pH-ului mediului de degradare al schelelor preparate cu creșterea timpului de incubație; ( C. ) Pierderea masei schelelor în perioada de demontare. O săgeată albă indică microsfere CH/nHA-AL. * p

Citocompatibilitatea in vitro a schelelor CM-AL. ( A. ) Morfologia celulară și aderența ASC-urilor de iepure pe schele sub SEM; ( B. ) Analiza citotoxicității ASC-urilor care au supraviețuit în leșierea schelelor folosind un test MTT; ( C. ) Activitatea fosfatului alcalin (ALP) a ASC-urilor în lichidul de leșiere a schelelor; ( D. ) Sinteza matricei mineralizate a fost analizată pentru depunerea calciului prin colorare cu roșu de alizarină. O săgeată albă indică microsfere CH/nHA-AL. * p # p

Analiza cu raze X a regenerării osoase în momente diferite după implantare. ( A. ) Radiografii reprezentative ale regenerării osoase în momente diferite. A existat o nouă formare osoasă în grupul de control, dar defectul osos nu a fost reparat; În grupul cu autogrefe, o grefă ortotopică autologă a permis vindecarea completă a defectelor de rază în timpul urmăririi de 8 săptămâni; În grupul de implanturi CM-AL (0%), a existat o nouă formare osoasă evidentă în săptămâna 8. Liniile de fractură osoasă au fost cu greu observate, în timp ce nu s-a găsit nicio reticulare a cavităților măduvei osoase. În grupul implantat cu CM-AL (10%), defectele osoase au fost vindecate prin formarea de os nou pe o perioadă de 4 până la 8 săptămâni. ( B. Analiza semiquantitativă a arătat o nouă formare osoasă semnificativă în CM-AL (10%) - grup implantat comparativ cu CM-AL (0%) - grup implantat, iar datele au crescut în timp. * p

Analiza histologică a regenerării osoase și a degradării schelelor în momente diferite după implantare. ( A. ) Colorarea HE care prezintă o cantitate mică de trabecule nou formate după 2 săptămâni în ambele grupuri CM-AL (0%) și CM-AL (10%). În săptămânile 4 și 8 au fost prezentate trabecule osoase grosiere și grupate cu structura vasculară clar vizibilă. Defectul umplut de țesut fibros era încă vizibil în grupul CM-AL (0%), în timp ce era mai puțin vizibil în grupul CM-AL (10%). ( B. ) Analiza cantitativă a arătat creșterea zonei osoase noi cu CM-AL încorporate și creșterea în zile. Săgețile albe indică zone de formare osoasă nouă, în timp ce săgețile negre indică cadrul (mărire: × 40). * p

Colorarea Masson a arătat maturarea treptată a osului nou format în ambele grupuri. Osul nou format a fost colorat în albastru puternic (așa cum arată săgeata albă) în săptămâna 2, iar zona albastră s-a micșorat treptat pe măsură ce osul s-a maturizat în săptămâna 8, indicând faptul că osteogeneza a început în ambele grupuri încă din săptămâna 2, dar procesul de osteogeneză a durat mai mult în grupul CM-AL (10%) decât în grupul CM-AL (0%) (mărire: × 40).

discuţie

Testul de degradare in vitro a arătat degradarea crescută a schelelor CM-AL cu conținutul crescut de CH/nHA-AL și nu a existat o diferență semnificativă de degradare între schelele CM-AL (10%) și controlul PLLA/nHA. Variația pH-ului în timpul degradării in vitro a schelelor poroase CM-AL a fost mai mică decât cea a schelelor PLLA/nHA, indicând degradarea atât a matricei PLLA, cât și a CM. Între timp, raportul de pierdere în greutate la schelele CM-AL a fost semnificativ crescut, în timp ce proprietățile mecanice au fost semnificativ mai mici. Aceste rezultate au fost în concordanță cu studiul anterior, care a indicat că pierderea în greutate a compozitelor pe bază de PLLA a crescut odată cu doza crescută de CM și acest lucru a fost atribuit dizolvării preferențiale a componentului chitosan din compozite 41. S-a sugerat că defalcarea rapidă a CM introduse contribuie la pierderea în greutate a schelelor în faza incipientă 37. În general, rezultatele noastre au arătat dovezi că schelele PLLA/nHA cu 10% CH/nHA-AL au prezentat proprietăți preferențiale, în timp ce creșterea conținutului de CH/nHA-AL la 20% a provocat efectul advers. Prin urmare, schelele PLLA/nHA cu 10% CH/nHA-AL au fost utilizate în studiile ulterioare.

Cu toate acestea, acest studiu are, de asemenea, unele limitări. Colorimetria albastră de molibden a fost utilizată în principal pentru a determina concentrația de AL pe baza anionului fosfat din apă. Deși metoda sa dovedit a fi reproductibilă, exactă și adecvată pentru determinarea AL 33, 48. Cu toate acestea, a fost utilizată apă distilată în locul PBS, care simulează pH-ul constant al fluidului din corp, deoarece o cantitate mare de fosfat din PBS poate interfera cu determinarea AL. Prin urmare, alte metode care pot simula mai bine starea fluidelor corporale pot fi luate în considerare pentru determinarea AL în lucrările noastre viitoare.

În concluzie, microsferele CH/nHA încapsulate au fost încorporate cu succes în schelele bazate pe PLLA/nHA și a fost dezvoltat un sistem de livrare bazat pe microsferă pentru livrarea AL și ingineria țesutului osos. Schelele CM-AL (10%) au prezentat o eliberare mai susținută a medicamentului și proprietăți mecanice și de degradare comparabile. Diferențierea osteogenică a ASC-urilor a fost, de asemenea, îmbunătățită, fapt demonstrat de activitatea ALP semnificativ crescută și depunerea de calciu. Studiile in vivo au arătat o vindecare osoasă excelentă a schelelor CM-AL (10%), comparabilă cu cea a grefelor automate. Rezultatele acestui studiu sugerează, prin urmare, aplicarea promițătoare a schelelor CM-AL (10%) pentru administrarea medicamentelor și ingineria țesutului osos.

Material si metode

Fabricarea PLLA

PLLA-urile au fost obținute prin polimerizarea lactidei prin deschiderea inelului. Pe scurt, monomerul L-lactidic (90%, Jiangxi Wuzangye Biochemical Industry Co., Ltd., Shanghai, China) a fost deshidratat la 140 până la 150 ° C timp de 4 până la 5 ore, urmat de deshidratare de decompresie la 2,5 până la 8,0 kPa și 170 ° C timp de 6-8 ore. Produsele au fost depolimerizate la lactidă în prezența octoatului stanos (0,27 kPa, 37 ° C). Lactida a fost purificată prin recristalizare repetată folosind acetat de etil ca solvent. Polimerizarea deschiderii inelului a fost efectuată pentru a produce PLLA în prezența lactidei și octoatului de staniu ca inițiator și catalizator (8000: 1). Copolimerul PLLA a fost caracterizat prin cromatografie cu permeație pe gel (GPC) și spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier așa cum a fost descris anterior 49.

Fabricarea cadrelor poroase CM-AL

Reprezentarea schematică a producției de schele PLLA/nHA/CM-AL pentru regenerarea osoasă la un model de iepure cu defecte osoase segmentare mari.

Caracterizarea cadrelor PLLA/nHA/CM-AL

Proprietăți de morfologie și porozitate

Morfologia schelelor PLLA/nHA/CM-AL a fost vizualizată prin microscopie cu lumină (Olympus U-RFL-T, Tokyo, Japonia) și microscopie electronică cu scanare (SEM, Nova NanoSEM230, SUA). Porozitatea schelelor a fost măsurată conform principiului Arhimede, așa cum s-a descris anterior 51. Pe scurt, cadrele au fost plasate într-un cilindru de măsurare care a fost umplut cu o anumită cantitate de etanol (V1). S-au înregistrat volumul total după imersie în schela (V2) și volumul de etanol care a rămas în cilindru (V3) după îndepărtarea schelei. Porozitatea a fost apoi determinată folosind următoarea ecuație:

Proprietăți mecanice

Cadrele cu o lungime de 20 ± 0,7 mm și o lățime de 7 ± 0,5 mm au fost produse și uscate în vid timp de 24 de ore. Proprietățile mecanice au fost măsurate folosind o mașină de testat mecanică universală Instron 1121 la temperatura camerei cu o rată de încărcare de 1,0 mm/min și o deformare mecanică de 2 mm. Modulul de compresie a fost calculat utilizând modulul dinamic al testerului de elasticitate DTM-II (Xiangyi Instruments Co., Ltd., Xiangyi, China). Au fost testate trei probe pentru fiecare probă.

Livrarea de medicamente in vitro

Eliberarea in vitro a medicamentului a fost măsurată conform metodei noastre anterioare, cu unele modificări 33. Pe scurt, fiecare schelă a fost plasată într-o pungă de dializă înmuiată în apă distilată (40 ml) și agitată timp de 25 de zile la 37 ° C și o viteză de 45 rpm. Supernatantul (2 ml) a fost colectat în fiecare zi și cuantificat printr-un test colorimetric albastru de molibden.

Degradare in vitro

Probele de schelă dreptunghiulară au fost scufundate în soluție tampon de fosfat (PBS) și monitorizate prin variația pH-ului și raportul de pierdere în greutate. PH-ul a fost măsurat o dată pe săptămână timp de 16 săptămâni. Pierderea în greutate a schelelor a fost observată la fiecare 4 săptămâni după uscare sub vid în perioada de demontare. Au fost făcute trei probe din fiecare schelă pentru fiecare punct de timp.

Test de biocompatibilitate in vitro

Morfologie celulară și test de adeziune

Schelele au fost cultivate împreună cu celule stem derivate din grăsime de iepure (ASC, Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, China) pentru testul de morfologie și adeziune celulară. Schelele au fost tăiate în bucăți mici (7mm x 7mm x 1mm) și sterilizate folosind sterilizarea cu plasmă la temperatură scăzută. ASC (1 × 104 celule/ml, 100 μl) au fost însămânțate pe schele și incubate timp de 2 ore într-un incubator la 37 ° C pentru a permite atașarea celulei. Apoi s-au adăugat cei 2 ml de mediu modificat Eagle (DMEM) Dulbecco suplimentat cu 10% ser fetal bovin pentru a se menține hidratat. În zilele 2 și 5 de cultură, schelele însămânțate cu celule au fost îndepărtate și spălate cu atenție de trei ori cu PBS. Celulele de pe schele au fost apoi imobilizate cu 4% formaldehidă și tetroxid de osmiu timp de 15-30 minute la 4 ° C și spălate cu atenție de 3 ori cu PBS. Probele au fost apoi deshidratate secvențial cu o serie de etanol (50, 70, 90, 95 și 100%) de două ori timp de 10 minute de fiecare dată. Probele au fost lăsate să se usuce într-un punct critic și acoperite cu aur pentru analiza SEM a morfologiei și aderenței celulare.

Test de citotoxicitate in vitro

Plăcile de schelă pătrată de 100 mg (14 plăci, 7 mm × 7 mm × 1 mm/placă) au fost sterilizate și imersate în 20 ml de mediu la 4 ° C timp de 48 de ore. ASC de iepure (5 × 104 celule/ml, 100 pl) au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri și cultivate într-un incubator la 37 ° C timp de 48 de ore, iar apoi mediul a fost reîmprospătat. Soluția MTT (1 mg/ml, 100 pl, Sigma-Aldrich) a fost adăugată la fiecare godeu în zilele 1, 3 și 5 și incubată timp de 4 ore la 37 ° C. După îndepărtarea supernatantelor, 150 um. l Dimetilsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich) adăugat pentru dizolvarea cristalelor albastre de formazan. Absorbanța a fost măsurată la 490 nm cu un cititor ELISA (Bio-Tek Instruments, Inc., Highland Park, VT, SUA).

Diferențierea osteogenică in vitro

Efectul osteogen al schelelor in vitro PLLA/nHA/CM-AL a fost analizat printr-o analiză a activității fosfatazei alcaline (ALP) și prin colorare cu roșu de alizarină. ASC de iepure (5 x 104 celule/ml, 120 pl/godeu) au fost însămânțate într-o placă cu 12 godeuri conținând fluide extrase din schele cu sau fără mediu osteogen (OGM, DMEM, 10% FBS, 100 nmol/l dexametazonă). 0,05 mmol/l acid ascorbic și 10 mmol/l & bgr; -Glicerofosfat). Activitatea ALP a fost măsurată în zilele 7 și 14, după cum s-a descris anterior 31. Pentru colorarea cu roșu de alizarină, mediul a fost schimbat la fiecare 3 zile. Celulele au fost obținute în zilele 7 și 14 și fixate în formaldehidă 4% timp de 15 minute. După spălarea de două ori cu PBS, probele au fost tratate cu roșu de alizarină (0,5 ml, 40 mmol/l, pH = 4,1) timp de 25 min. Imaginile au fost apoi realizate la microscopul optic inversat (Nikon, Tokyo, Japonia). Procentele de celule pozitive au fost calculate din cel puțin 3 câmpuri selectate aleatoriu.

Regenerarea osoasă in vivo

analize statistice

Datele au fost exprimate ca medie ± deviație standard (SD). Experimentele au fost realizate în trei exemplare. Comparațiile statistice au fost făcute prin testul t Student sau analiza unică a varianței (ANOVA), după caz. Valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative statistic.

mulțumire

Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (Grant nr. 81371934, Nr. 81501860 și Nr. 31470948) și finanțată parțial de Consiliul de burse din China (Grant nr. 201506370173).

Observații

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord cu termenii noștri de utilizare și cu regulile comunității. Dacă găsiți ceva abuziv sau care nu respectă termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind inadecvat.