Rolul celulelor progenitoare endoteliale la pacienții cu spondiloartropatie axială - PDF
1 De la Clinica de Nefrologie și Reumatologie (Prof. Dr. med. GA Müller) al Facultății de Medicină a Universității din Göttingen Rolul celulelor progenitoare endoteliale la pacienții cu spondiloartropatie axială DISERTATURA INAUGURĂ pentru obținerea titlului de doctor al Facultății de Medicină a Universității Georg August zu Göttingen prezentat de Maria Elisabeth Vogt, geb. Struve de la Frankfurt an der Oder Göttingen 2018
2 Decan: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer Vorbitor: Co-Vorbitor: Al treilea Vorbitor: Priv.-Doz. Dr. med. Susann Patschan Prof. Dr. med. Rotraut Mößner Prof. Dr. med. Margarete Schöm Data examenului oral: 12 iunie 2019
3 Declar prin prezenta că am pregătit disertația cu titlul Rolul celulelor progenitoare endoteliale la pacienții cu spondiloartropatie axială și că nu am folosit alte surse sau ajutoare decât cele indicate de mine. Osnabrück,.
4 Conținutul listei de figuri. VI Lista tabelelor. VII Lista abrevierilor. VIII 1. Introducere și obiective Introducere Spondiloartrită și spondiloartropatie axială Definiție și istoric Epidemiologie/cursul bolii Patogeneză Clinică și curs Diagnostic Examen fizic Scoruri Criterii de clasificare Laborator de imagistică Terapie/managementul AS Ateroscleroză/risc cardiovascular la pacienții cu vasculogeneză endotelială axilară și angiogeneză Privire de ansamblu endotelială Endotelial Descriere experimentală; Izolarea și cultivarea EPC-urilor și a diferitelor citokine Alte stimulente și factori inhibitori ai numărului EPC EPC-urilor în contextul condițiilor patologice Starea cercetării Material și metode Achiziția colectivă și a datelor pacientului Determinarea scorurilor EPC-urilor și metodele de examinare clinică IV
5 3.4 Analiza statistică a rezultatelor colective ale pacienților Rezultatele analizei Hill CFU Analiza FACS Mediatori vasomodulatori Curs Rezumatul discuțiilor Anexa Bibliografie V
7 Lista tabelelor Tabelul 1: Lista consumabilelor utilizate 38 Tabelul 2: Rezumatul instrumentelor/dispozitivelor utilizate 39 Tabelul 3: Lista reactivilor utilizați 39 Tabelul 4: Statistici descriptive ale caracteristicilor de bază ale colectivului de pacienți 46 Tabelul 5: Măsurători clinice pentru evaluarea mobilității coloanei vertebrale/evoluția bolii 46 Tabelul 6: Statistici descriptive pentru numărul de CFU-EC din grupul de pacienți și grupul de control 47 Tabelul 7: Lista valorilor p pentru numărul de CFU-EC, clasificate în funcție de diferite variabile/caracteristici 48 Tabelul 8: Statistici descriptive pentru numărul de CFU-EC, clasificate în funcție de sex 49 Tabelul 9: Statistici descriptive pentru numărul de CFU-EC, clasificate în conformitate cu ASDAS 52 VII
8 Listă de abrevieri acldl = anchiloză lipoproteică cu densitate scăzută acetilată = rigidizare articulară completă AS = spondilită anchilozantă = spondilită anchilozantă ASAS = Evaluarea SpondiloArtritei Societatea internațională ASDAS = Spondilită anchilozantă Scorul de activitate al bolii axspa = Spondilartropatie de scăldat Indice Anchiloză Bazilică Indicele funcțional BASG = Spondilita anchilozantă de baie Scor global BASMI = Spondilita anchilozantă de baie Metrologie Index BSA = albumina serică bovină BSG = rata de sedimentare CAC = celula angiogenă circulantă CD = grup de diferențiere CEC = celula endotelială circulantă, celulele endoteliale circulante CFU = boala inflamatorie intestinală unitate formatoare CFU-EC = celulă endotelială formând colonii CPC = celulă progenitoare circulantă CRP = proteină C reactivă DMARD = medicament antireumatic modificator de boală ECFC = celulă formatoare de colonii endoteliale ELISA = imunosorbent legat de enzime nt Analiza Enteza = inflamație în zona atașamentelor de tendon, ligament sau capsulă EC = celule endoteliale ecfc = excrescențe târzii EPC EPC = celula progenitoare endotelială VIII
9 ESSG = Grupul european de studiu asupra spondiloartropatiei FACS = sortarea celulelor activate de fluorescență FBA = distanța deget-podea FLK-1 = receptor VEGF-2 CD309 KDR HDL = lipoproteină de înaltă densitate HLA = antigen leucocitar uman HSC = celulă stem hematopoietică IL-6 = Interleukin-6 KDR = receptor kinază insert receptor KHK = boală cardiacă coronariană LDL = lipoproteină cu densitate scăzută LWS = coloană lombară MC = celulă stem mieloidă MRT = imagistică prin rezonanță magnetică NO = oxid azotic AINS = medicamente antiinflamatoare nesteroidiene nr-fosfat-artografic-axialhritic-spondat PDGF salin = factor de creștere derivat din trombocite PPI = inhibitori ai pompei de protoni RA = artrită reumatoidă SDF-1 = factor derivat din celula stromală 1a SpA = spondiloartrită, spondiloartropatie, spondiloartropatie TGF = factor de creștere transformant TPC = celulă progenitoare rezidentă a țesutului IX VEGF = factor de creștere endotelial vascular
11 Au fost cercetate următoarele întrebări: 1. Ce rol joacă EPC în spondiloartropatia axială? 2. Numărul sau funcționalitatea acestora s-au schimbat în comparație cu grupul de control sănătos? 3. Numărul sau funcția EPC se corelează cu severitatea cursului clinic, terapia medicamentoasă utilizată sau activitatea bolii? 4. EPC joacă un rol în progresia bolii la fiecare pacient? Se speră că rezultatul studiului nostru ar putea avea un efect asupra opțiunilor terapeutice sau asupra parametrilor de prognostic. 2
19 Factorii de prognostic semnificativ nefavorabili conform unui studiu francez sunt, pe lângă coxită, o VSH> 30, un răspuns slab la terapia cu AINS, mobilitate restrânsă a coloanei lombare, un debut precoce al bolii (înainte de vârsta de 17 ani), manifestări de organe sau oligoartrită (Puchner 2012). Consumul de nicotină și neglijarea sau fizioterapia efectuată doar ocazional au, de asemenea, un efect negativ asupra cursului. Mortalitatea este deosebit de mare din cauza unui risc cardiovascular crescut (Manger și Schulze-Koops 2012). 10
24 de blocante TNF-α provoacă remisie completă la peste 50% dintre pacienții cu spondiloartropatie axială (Barkham și colab. 2009). Toate măsurătorile de progres (BASDAI, BASFI, BASMI) s-au îmbunătățit după 24 și 102 săptămâni și parametrii inflamației s-au normalizat (Braun și Sieper 2007). Potrivit lui Haroon și colab. (2013), terapia cu blocante TNF-α, mai ales dacă a început într-un stadiu incipient al bolii, pare să reducă progresul radiografic. Terapia chirurgicală este doar o opțiune pentru pacienții selectați cu dizabilități fizice, de exemplu, cu o coloană vertebrală instabilă. În plus față de terapia farmacologică, măsurile non-medicamentoase, în special fizioterapia, joacă un rol fundamental. Studiile arată că, atunci când terapia cu efort este efectuată în mod regulat, se poate demonstra o îmbunătățire a funcției fizice, a durerii și a bunăstării generale (Dagfinrud și colab. 2008). 15
48 materiale Dispozitiv INCUBATOR CO2 (dulap de încălzire) Pipete Eppendorf Frigider congelator FACS-Calibur Microscop: Microscop diavert cu cultură celulară inversă Olympus IX-81 banc steril Centură de aer curată CA/R Vortex Genie 2 centrifugă: Megafuge 1.0R centrifugă: Rotixa/A producător Sanyo Eppendorf AG, Hamburg Becton Dickinson Sanyo Liebherr Leica Microsystems Olympus Biohazard Bodo Schmidt GmbH Heraeus instruments GmbH Hettich Tabelul 2: Rezumatul instrumentelor/dispozitivelor utilizate Substanță Număr catalog producător Biocoll 1.0777 g/ml Biochrom AG, Belin L6115 BSA ph 7.0 LabClinics SA K Dil AcLDL Molecular Probes L3484 Endocult Basal Medium StemCell Technologies Inc Supliment Endocult StemCell Technologies Inc Reactiv de blocare FcR Millenyi Biotec Fibronectin FLK = Sisteme anti-umane de cercetare și dezvoltare mouse, Minneapolis FAB 357F VEGFR2 Formalin Clorhidrat Lectină de la Ulex europaeus SIGMA-ALDRICH secundar L9006-1 Anticorpi PE Jackson Immunoresearch, Baltimore, SUA Tabelul 3: Lista reactivilor utilizați 39
50 Distanță deget-podea (FBA) Pacientul se apleacă înainte cât poate cu picioarele drepte. Se măsoară distanța dintre vârful degetului mijlociu și podea. Această valoare măsurată este utilizată pentru a evalua coloana vertebrală, precum și articulațiile șoldului și mușchii ischiocrurali. Este adesea folosit în clinică pentru a monitoriza progresul (Feldtkeller și van der Heijde 2005). Înclinarea laterală a coloanei vertebrale Cu pacientul în poziție verticală, se măsoară distanța dintre podea și vârful degetului mijlociu extins pe corp. Se face o nouă măsurare cu înclinare laterală maximă, cu picioarele încă drepte (fără rotație!). Valoarea medie se formează din diferența dintre prima și a doua valoare, măsurată pentru ambele părți (norma> 10 cm) și este utilizată pentru a calcula BASMI (van der Heijde și colab. 2008). Figura 10: Reprezentarea schematică a înclinației laterale a coloanei vertebrale (pentru detalii despre măsurare, vă rugăm să consultați textul) Distanța gleznei Această măsură este utilizată pentru a evalua mobilitatea articulației șoldului. Cu pacientul culcat, distanța dintre glezne interioare se măsoară cu picioarele cât mai largi posibil (genunchii extinși, degetele îndreptate în sus) (norma> 100 cm). Această valoare este inclusă în BASMI (Feldtkeller și van der Heijde 2005). 41
51 Distanța Tragus-perete Această măsurare este utilizată pentru a evalua cifoza. Distanța dintre tragus și perete se măsoară cu pacientul în picioare în poziție verticală, cu spatele și tocurile de perete și face parte, de asemenea, din BASMI (Feldtkeller și van der Heijde 2005). Figura 11: Reprezentare schematică a distanței tragus-perete, (pentru detalii despre măsurare, vă rugăm să consultați textul) Rotația coloanei vertebrale cervicale Cu pacientul așezat în poziție verticală și privind drept înainte, capul este rotit la dreapta și la stânga cât mai mult posibil (standard > 70). Unghiul dintre rotația maximă și poziția zero este utilizat pentru a calcula BASMI. Umerii nu trebuie întoarse în același timp (Feldtkeller și van der Heijde 2005). BASMI Indicele de metrologie pentru spondilita anchilozantă de baie este format din diferite măsurători clinice pentru a evalua mobilitatea coloanei vertebrale și orice restricții. Acestea includ măsura Schober modificată, înclinarea laterală a coloanei lombare, distanța maximă a gleznei, distanța tragus-perete, rotația coloanei cervicale (pentru calcul, vezi anexa). Acest indice a fost introdus în orașul englez Bath în 1994. În 42
53 3.4 Evaluare statistică Rezultatele au fost evaluate utilizând programul STATISTICA de la statsoft. În primul rând, datele au fost testate pentru distribuția normală utilizând testul Shapiro-Wilks-W. Statistica folosește o extensie a acestui test descrisă de Royston 1992. Nu există o distribuție normală în datele colectate. Mai mult, statisticile descriptive, în special cu valoarea medie și abaterea standard, au fost create folosind STATISTICA. Deoarece nu există o distribuție normală, au fost utilizate metode non-parametrice pentru a testa semnificația statistică. Testul Mann-Whitney U a fost folosit pentru aceasta. Spre deosebire de testul t normal cu distribuție normală, acest lucru nu se bazează pe valorile medii, ci pe baza rangurilor. O diferență semnificativă, adică o asociere peste întâmplare, a fost definită cu o valoare p sub un nivel de semnificație de 0,05. Pentru a ilustra relațiile dintre diferite variabile, coeficientul de corelație a fost calculat folosind R-ul lui Spearman, la fel ca și nivelul de semnificație. Pentru a ilustra rezultatele au fost create graficele de tip cutie și graficele de dispersie. 44
64 CFU-EC și fumatul Există o tendință către un număr mai mic de CFU-EC la fumători. Cu toate acestea, diferența față de nefumători nu este semnificativă statistic (p = 0,37). 70 Box-Whisker-Plot CFU și consum de nicotină Valoare medie CFU + SD: consum de nicotină fără consum de nicotină consum de nicotină fără consum de nicotină valoare medie ± stdf. Valoare medie ± 1,96 * stdf. Valori extreme extremiste Figura 18: Numărul de CFU-EC, clasificate în funcție de consumul de nicotină 55
65 4.3 Analiza FACS Pentru evaluarea cantitativă a cepcurilor, probele de pacienți au fost preparate și analizate folosind un dispozitiv FACS. Celulele dublu pozitive pentru CD133 și FLK corespund cepcs. În comparație cu grupul de control sănătos, nu se observă nicio diferență semnificativă aici. Media și mediana sunt aproape identice (p = 0,69, N pacienți = 49, N grup de control = 10). De asemenea, nu s-a putut arăta nicio corelație semnificativă statistic între CFU-EPC măsurate și celulele CD133 +/FLK + măsurate de FACS. 8 grafic de mustață cutie pentru pacienții cu celule CD133/FLK dublu pozitive și grupul de control 7 6 media celulelor CD133/FLK pozitive + SD: pacienți - 0,97 + 1,65 grup de control - 0,75 + 0, pacienții grupul de control media medie ± Stdf. Valoare medie ± 1,96 * stdf. Valori extreme anterioare Figura 19: cepcs (în%) la pacienți și grupul de control. 56
66 FACS și activitatea bolii O defalcare a cepcilor în funcție de activitatea bolii, măsurată prin BASDAI, a arătat o tendință statistic nesemnificativă către un număr mai mare de cepci cu activitate mare a bolii (corespunzător BASDAI> 4; p = 0,1). FACS și sex Clasificarea cepcilor măsurată de FACS în funcție de sex nu a prezentat nicio diferență semnificativă (p = 0,08). Există o tendință către un număr mai mic de cepci la pacienții de sex masculin. 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 Box-Whisker-Plot Numărul de EPC (în%) defalcat pe sex EPC 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 Media + SD: Femeile 1,45 + 2,3 bărbați 0,62 + 0,8 0,4 femei bărbați media medie ± stdf. Valoare medie ± 1,96 * stdf. Figura 20: cepci (în%) clasificați în funcție de sex 4.4 Mediatori vasomodulatori Diferențele dintre concentrațiile diferiților mediatori vasomodulatori (VEGF, PDGF, TGF-β, angiopoietină -1 și -2) în grupul de control și la pacienți nu au fost semnificative statistic. 57