Separarea proteinelor pentru spectroscopie de masă - LABO ONLINE

Proteine separate pentru spectroscopie de masă

O estimare simplă se transformă în măsurători multiple

Electroforeza capilară bidimensională permite caracterizarea online a proteinelor separate prin electroforeză pe gel folosind spectrometria de masă. Această metodă este descrisă de autori în articolul lor pentru LABO.

Electroforeza pe gel pentru a separa proteinele în funcție de mărimea lor a fost introdusă acum 50 de ani [1] și a devenit cea mai răspândită tehnologie de separare de acest gen. Dodecil sulfatul de sodiu (SDS), care formează un complex cu proteinele, se adaugă proteinei sau amestecului de proteine care urmează să fie analizat. Sarcina negativă rezultată a complexului SDS-proteină acoperă sarcina intrinsecă a proteinei și este proporțională cu mărimea proteinei. Ca rezultat, cu rapoarte de încărcare-masă similare, complexele sunt separate teoretic numai pe baza mărimii lor într-un câmp electric de un gel de separare, de obicei un gel de poliacrilamidă (PAGE). Prin compararea migrației proteinelor de analizat cu migrarea proteinelor cu mase cunoscute, masa necunoscută poate fi estimată prin extrapolare. SDS-PAGE este utilizat pentru a determina masele de proteine și pentru a separa amestecurile complexe de proteine în funcție de mărimea lor.

Datorită cheltuielilor de laborator și de timp relativ ridicate, această tehnologie de analiză a fost optimizată astfel încât separarea nu mai are loc într-un pat de separare, ci într-un capilar din sticlă de cuarț (CE (SDS)). Acest capilar are un diametru interior de cel mult 50 µm și este umplut cu un tampon de gel de separare. Acest lucru diferă de gelul de separare utilizat în mod convențional în SDS-PAGE prin aceea că se folosesc polimeri liniari solubili în apă sau doar ușor reticulați (în loc de polimeri reticulați) pentru a putea schimba tamponul de gel de separare în capilar [2]. Separarea în capilar poate fi astfel automatizată și reproductibilitatea este crescută. Un alt avantaj important al separării în capilar este detectarea online prin absorbție UV sau fluorescență, ceea ce face posibilă formularea de declarații cantitative, iar fixarea și colorarea consumatoare de timp a proteinelor separate, ca și în cazul SDS-PAGE, nu mai sunt necesare.

Subiecte din articol

CE (SDS) este utilizat pe scară largă în industria biofarmaceutică pentru a testa sau caracteriza puritatea și produsele de degradare ale proteinelor terapeutice, cum ar fi anticorpii. Prin urmare, centrul analizei este separarea și cuantificarea fragmentelor care apar. Identificarea acestor fragmente este un alt punct important, deoarece acestea pot afecta eficacitatea proteinei terapeutice și, astfel, siguranța pacientului.

Determinarea incorectă a masei prin extrapolare

Identificarea se dovedește a fi o provocare enormă. Deoarece eficiența de separare a CE (SDS) nu este adesea suficientă, poate duce la ascunderea mai multor fragmente în spatele unui vârf. Acest lucru face mai dificilă atribuirea vârfurilor la fragmente folosind experimente de spiking (adăugarea de fragmente care au fost deja identificate și observarea creșterilor în zona vârfurilor). Identificarea utilizând masa proteică estimată prin extrapolare nu este, de asemenea, posibilă. Deoarece indiferent dacă separarea proteinei SDS are loc în capilar sau în gelul polimerizat, determinarea masei este inexactă. În plus, raportul dintre SDS legat și proteină poate diferi în funcție de secvența și structura proteinei, ceea ce înseamnă că masa specifică se poate abate și mai mult de la masa reală [3 - 4].

Determinarea imprecisă a masei nu permite o identificare clară a impurităților. Totuși, determinând masa exactă a acestor fragmente utilizând spectrometria de masă (MS), identificarea este posibilă. Din păcate, o cuplare directă a CE (SDS) nu este posibilă, deoarece tamponul de gel de separare foarte vâscos conține dextran și componente nevolatile precum boratul - dar mai presus de toate surfactantul SDS, ceea ce duce la suprimarea completă a proteinei în procesul de ionizare [5]. Nu este posibilă extinderea acestei metode CE (SDS) pentru o posibilă colectare a fracțiunilor cu o pregătire ulterioară de probă offline în ceea ce privește compatibilitatea MS, din cauza volumelor mici și a tamponului de gel de separare foarte vâscos.

Spectrometrie de masă online prin electroforeză capilară bidimensională

Abordarea noastră pentru o cuplare MS online se bazează pe comutarea unei a doua dimensiuni de separare sub formă de electroforeză a zonei capilare (CZE) între separarea CE (SDS) și MS (Fig. 1a) [6]. Acest lucru permite separarea componentelor incompatibile cu MS de analit. Pentru a rezolva complexul SDS-proteină foarte stabil necesar separării anterioare, este necesară prelucrarea suplimentară a probelor. Pentru această decomplexare a complexului SDS-proteină, a fost deci dezvoltată o strategie online în a doua dimensiune de separare. Aceasta constă în co-injecția unui solvent organic (aici metanol) și a unui agent tensioactiv cationic (aici bromură de cetiltrimetilamoniu (CTAB)), care este poziționat înainte sau după complexul proteic SDS în capilarul celei de-a doua dimensiuni de separare.

Cuplarea separării generice CE (SDS) în prima dimensiune de separare cu CZE în a doua dimensiune de separare are loc printr-o supapă nanoliteră cu patru conexiuni (VICI). Cu această supapă este posibilă aplicarea unei tensiuni ridicate (până la aproximativ 15 kV), care este necesară pentru separare. O buclă internă de probă în domeniul nanoliterilor (4, 10 sau 20 nl) permite ca aceste volume foarte mici să fie transferate de la o dimensiune la alta.

Măsurarea fragmentelor unui anticorp intact, stresat termic cu sistemul de electroforeză capilară bidimensională este prezentat în Figura 2. A fost posibil să se genereze spectre de masă ale ambelor vârfuri în dimensiunea CE (SDS). A devenit evident că nu doar unul, ci mai multe fragmente sunt ascunse sub fiecare vârf CE (SDS). Pentru vârful 1 (Fig. 2, albastru) fragmentul 1C (23439,4 ± 1,5 Da) ar putea fi atribuit lanțului ușor al anticorpului. Fragmentul 1B cu o diferență de masă de 103,7 Da la lanțul ușor 1C s-ar putea datora unei clivări C-terminale a cisteinei și 1A unei eliminări suplimentare de apă. Pentru al doilea vârf CE (SDS) (Fig. 2, verde) au existat, de asemenea, trei fragmente de anticorpi. Masa vârfului 2C de 47638,2 ± 0,7 Da a fost identificată ca un fragment Fab. Eliminarea ultimilor doi (T-H, ∆M = 238,2 Da) sau a trei aminoacizi (K-T-H, ∆M = 366,2 Da) cu eliminarea apei din acest fragment Fab are ca rezultat vârfurile de masă 2B și 2A.

Concluzie și perspectivă

Cu metoda de electroforeză capilară bidimensională prezentată aici, este posibil să se obțină spectre de masă online ale proteinelor separate anterior de CE (SDS) fără alte preparări de probă. Cu dimensiunile exacte, este posibil să se identifice contaminanții din produsele biofarmaceutice și să se sprijine optimizarea proceselor pentru fabricarea medicamentelor corespunzătoare.

Literatură:
[1] Laemmli Nature 1970, 227, 680-685.
[2] Zhu și colab. Anal Chim Acta. 2012, 709, 21-31.
[3] Guan și colab. Sci Rep 2015, 5, 13370.
[4] Rath și colab. Proc Natl Acad Sci SUA 2009, 106 (6), 1760-1765.
[5] Rundlett și colab. Anal Chem 1996, 68 (19), 3493-3497.
[6] Römer și colab. Anal Bioanal Chem 2019, 411 (27), 7197-7206.

AUTORI

Jennifer Romer 1
Cristina Montealegre 1
Bernd Moritz 2
Steffen Kiessig 2
Christian Neusüß 1
1 Universitatea Aalen, departamentul de chimie
2 F. Hoffmann-La-Roche Ltd, Basel, Elveția