Studii privind distribuția celulelor imune în sângele periferic la un obez indus de dietă
1 De la Institutul de Anatomie și Biologie Celulară al Facultății de Medicină a Universității Martin Luther Halle-Wittenberg Director: Prof. Dr. med. Heike Kielstein Investigații privind distribuția celulelor imune în sângele periferic într-un model de șobolan obez indus de dietă după inducerea tumorii Disertație pentru obținerea diplomei universitare de doctor în medicină (Dr. med.) Prezentată la Facultatea de Medicină a Universității Martin Luther Halle-Wittenberg de Dorle Knauf născut în Freiberg (Saxonia) Recenzent: 1. Prof. Dr. med. Heike Kielstein 2 PD Dr. med. Hans-Jürgen Seyfarth (Leipzig) 3. Prof. Dr. med. Thoralf Lange (Weißenfes)
5 au prezentat metastaze pulmonare la animale obeze. Aceste limitări numerice detectabile inițial ale celulelor NK și ale monocitelor ar putea fi, de asemenea, responsabile pentru faptul că așezarea celulelor MADB106 în plămâni și astfel formarea metastazelor pulmonare la animalele obeze este în primul rând posibilă și progresează mai rapid.
7 Cuprins I Cuprins Pagina 1. Introducere Obezitate Țesut adipos Influența adipokinelor asupra celulelor imune Boli tumorale asociate obezității Obiectiv Material și metode Testare animale și creștere Configurare experimentală Model tumoral Injecția celulelor MADB106 sau NaCl Obținerea și analiza materialului eșantion Eliminarea sângelui și a organelor Extracția lipidelor și determinarea concentrației Determinări imunologice Izolarea PBMC și liza eritrocitară conform Schwinzer Determinarea numărului PBMC utilizând o cameră de numărare Neubauer Colorarea celulelor imune specifice folosind anticorpi cuplați fluorocrom Măsurători citometrice de flux folosind evaluarea FACS FACS Cuantificarea celulelor NK, a celulelor tumorale și a contactelor celule NK-celule tumorale sau metastaze superficiale Țesutul pulmonar Determinarea concentrațiilor relative de mrna în țesutul splinei la șobolani F344 cu greutate normală sau obezi folosind statistici PCR în timp real 26
8 Cuprins II 3. Rezultate Dezvoltarea în greutate a animalelor testate Experiment pe termen scurt Experiment pe termen lung Concentrații de trigliceride și colesterol în ficat Sortare de celule activate de fluororezi (FACS) - măsurători în experimentul pe termen scurt Celule NK Limfocite B Limfocite T Citotoxice (CD8 +) T -Celule T-helper monocytes (CD4 +) monocytes Fluorezens activate cell sorter (FACS) - măsurători într-un experiment pe termen lung Celule NK Limfocite B Limfocite T citotoxice (CD8 +) Celule T T-helper cells (CD4 +) cuantificarea monocitelor Celulele NK Celulele MADB106 și interacțiunea celulă NK-celulă tumorală, precum și metastazele pulmonare superficiale Concentrația relativă de mrna a receptorilor de celule NK care activează și inhibă și a citokinelor specifice celulelor NK în țesutul splinei Concentrații relative de mrna în experimentul pe termen scurt Concentrații în experimentul pe termen lung Rezumatul discuțiilor Bibliografie 58
9 Cuprins III 7. Teze 68 Declarație de independență Declarație privind încercările anterioare de doctorat Curriculum vitae tabelar Mulțumiri
10 Lista abrevierilor IV Lista abrevierilor ANOVA APC BMI CD CFSE CRP DIO FACS FITC IFNγ IL i.v. JAK-STAT KIR MALT MCP-1 MHC Celule MP-NK mrna Ms IgM/G NaCl NKG2D Celule NK PBS PBMC PCR PE Analiza variației Aloficocianină Indice de masă corporală Cluster de diferențiere Ester succinimidil carboxifluoresceinic Esterul reactiv C-reactiv Fluorescența indusă de dietă Sortare celulară activată Fluoresceină izotiocianat Interferon Gamă Interleukină intravenoasă Januskinază - Transductori de semnal și activatori ai transcripției Celule ucigașe Receptori asemănători imunoglobulinei Mucoza Asociată țesutului limfoid Monocit Proteină chimiotactică 1 Histocompatibilitate majoră Marginare-pulmonară-imunoglobină pulmonară-imunoglobină Killer Group 2, Membru D Celule killer naturale Fosfat tamponat cu soluție salină Sânge periferic Mononuclear Cell Cell Mononuclear Polymerase Chain Reaction Phycoerithrin
11 Lista abrevierilor V PE-Cy7 Ficoeritrin-cianină 7 PPARγ RPMI Mediu SEM Peroxizom Proliferator Activare Receptor-Gamma Roswell Park Memorial Institute Mediu Eroare standard a mediei T H1/2 T celule helper 1/2 T Reg TNFα OMS T celule regulatoare tumorale -Necroza Factor Alpha Organizația Mondială a Sănătății
32 Interpretarea materialului și a metodelor 21. În cele din urmă, proprietățile celulare determinate au fost prezentate sub forma unei histograme sau a unui grafic de puncte. Astfel, în mai puțin de un minut, mai mult de zece mii de celule ar putea fi alocate unei populații sau subpopulații respective. Fig. 5: Reprezentarea schematică a metodei de citometrie în flux. Cu ajutorul lentilelor speciale, celulele sunt analizate folosind lumină împrăștiată înainte (împrăștiere FSC înainte) și lumină împrăștiată lateral (dispersie laterală SSC). Oglinzile au fost folosite pentru a alinia semnalele luminoase astfel încât acestea să poată fi preluate de către detectoare și transformate în semnale de tensiune electrică. Evaluare FACS Utilizând măsurătorile citometrice de flux, celulele B și T, celulele NK și monocitele au fost examinate diferit (Fig. 6, 7). Fig. 6: Populații de celule B, T și monocite analizate Fig. 7: Populații de celule NK analizate
34 Material și metode 23 celule T citotoxice Figura 10: Grafic punct reprezentativ al unei colorări a celulelor T citotoxice sau a celulelor T-helper; celule T citotoxice (CD8a PE +, CD4 PE-Cy7 -) în cadranul superior stâng; Celulele T helper (CD8a PE -, CD4 PE-Cy7 +) din cadranul inferior drept. Figura 11: Reprezentarea punctului reprezentativ al unei colorații monocite; Monocite (CD4 PE-Cy7 +, CD3 APC -) Celule NK nu celule NK Figura 12: Grafic punct reprezentativ al unei colorări a celulei NK; Celule NK [CD161a luminoase (CD161a PE +, CD3 APC -)] în cadranul stânga sus, celule non-nk [CD161a dim (CD161a PE +, CD3 APC -)] în cadranul stânga jos. Figura 13: Poarta CD161a PE, minime la 10 4.1 pentru celulele NK (CD3 -/CD161a luminoase) și 10 2.2 pentru celulele non-nk (CD3 -/CD161a dim)
37 Statistică despre materiale și metode Evaluarea statistică a fost efectuată utilizând software-ul GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, SUA). Datele au fost evaluate utilizând o analiză unidirecțională a varianței (ANOVA) și un test ulterior de comparare multiplă a lui Tukey. Pentru a putea determina efectele generale ale dietei și celulelor tumorale independent de celălalt factor, a fost efectuat un test ANOVA cu două căi, cu un test Bonferroni ulterior. Limita de semnificație pentru ambele teste s-a bazat pe o probabilitate de eroare de cel mult 5% (P 0,05).
38 Rezultate Rezultate 3.1 Dezvoltarea greutății animalelor testate Testul pe termen scurt Greutatea corporală medie a animalelor testate la începutul testului a fost de 183,54 g în grupul martor și de 183,76 g în grupul DIO. Șobolanii care au primit dieta de control normocaloric pe o perioadă de șase săptămâni și-au crescut greutatea medie cu 58% până la 290 ± 2,6 g în acest timp. În schimb, animalele care au primit dieta DIO bogată în calorii și-au crescut greutatea corporală cu 65,5% până la o medie de 304 ± 3,9 g (Tabelul 3). La momentul injectării celulelor tumorale sau a purtătorului de NaCl, animalele hrănite cu DIO au atins astfel o greutate corporală semnificativ mai mare comparativ cu animalele care au primit dieta de control (P = 0,006), (Fig. 16). Tab. 3: Dezvoltarea greutății șobolanilor martor și DIO în experimentul pe termen scurt săptămâni după începerea dietei Dezvoltarea greutății 183,54 ± 1,5 212,37 ± 1,6 238,13 ± 2,3 255,2 ± 2,34 268, 34 ± 2,4 284,16 ± 2,75 290,24 ± 2,62 control [g] dezvoltare greutate DIO [g] 183,76 ± 1,6 227,18 ± 1,79 251,02 ± 2,61 271 .05 ± 2,79 283,24 ± 3,46 297,47 ± 3,8 304,11 ± 3,88 Sunt prezentate valorile medii și eroarea standard corespunzătoare (± SEM); n = 8 șobolani/grup
40 Rezultate 29 Tab. 4: Dezvoltarea greutății șobolanilor martor și DIO în experimentul pe termen lung săptămâni după începerea dietei Controlul dezvoltării greutății [g] 195,53 ± 1,81 222,59 ± 2,17 245,93 ± 2,46 259, 45 ± 2,81 271,8 ± 2,88 284,29 ± 3,08 294,75 ± 3,02 Dezvoltare greutate DIO [g] 195,53 ± 2,07 227,28 ± 2,47 253,74 ± 3, 33 269,09 ± 3,68 277,51 ± 4,51 294,16 ± 4,14 304,78 ± 4,43 săptămâni după începerea dietei Controlul creșterii în greutate [g] 302,76 ± 3,48 310,51 ± 3, 68 318,04 ± 3,66 329,58 ± 4,09 328,73 ± 4,38 332,49 ± 4,75 332,9 ± 5,47 Dezvoltare greutate DIO [g] 312,69 ± 4,98 327, 54 ± 5,90 336,25 ± 6,66 351,76 ± 7,21 352,66 ± 7,34 355,67 ± 7,31 367,84 ± 9,19 Sunt prezentate valorile medii ± SEM; n = 8 șobolani/grup. Linia întreruptă la tranziția de la a 10-a la a 11-a săptămână după începerea experimentului ilustrează momentul în care se injectează celulele MADB106 sau NaCl.
41 Rezultate 30 Greutatea corporală în g * * * * * * * DIO control i.v. injecție săptămâni după începerea dietei Fig. 17: Dezvoltarea greutății după 13 săptămâni de hrănire cu dieta de control și dieta DIO. Sunt prezentate valorile medii ale greutăților tuturor animalelor testate (n = 8), ± SEM. Injecția i.v. a celulelor tumorale sau a purtătorului (NaCl) a avut loc după 10 săptămâni. Momentele la care ponderile grupului DIO diferă semnificativ de cele ale grupului de control sunt marcate cu *. 3.2 Concentrațiile de trigliceride și colesterol în ficat Concentrațiile de trigliceride și colesterol în ficat au fost, de asemenea, semnificativ mai mari la șobolanii DIO comparativ cu animalele de control (Tab. 5). Tab. 5: Greutatea corporală, concentrația de trigliceride și colesterol în ficat la animalele martor și DIO în experimentele pe termen scurt și lung Experiment pe termen scurt Experiment pe termen lung Injecție MADB106 Injecție MADB106 21 zile după injecția MADB106 g) Control 38 ± 8 38 ± 4 DIO 90 ± 15 * 65 ± 9 * Colesterol în ficat (µmol/g) Control 6,7 ± ± 0,3 DIO 11,0 ± 1,6 * 9,3 ± 0,8 * afișat sunt mijloacele ± SEM; n = 8 șobolani/grup; valori semnificative indicate prin *, P 0,05; TG = trigliceride
42 Rezultate FACS - Măsurători în celulele NK din experimentul pe termen scurt Evaluarea numărului de celule NK după expunerea scurtă la tumoră pe parcursul a 15 minute a arătat diferențe semnificative între animalele de control și animalele DIO. Șobolanii hrăniți cu DIO au avut semnificativ mai puține celule NK decât animalele martor (prezentate ca% din PBMC) decât animalele martor (4,3 ± 0,07 față de 3,95 ± 0,38 (SEM)% PBMC, Fig. 18). Celule NK (% din PBMC) KoNaCl KoMADB106 * DIONaCl DIOMADB106 Figura 18: Evaluarea cantitativă a numărului de celule NK la șobolanii F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dieta de control (Ko) și la 15 minute după MADB106- Injecție de celule tumorale (MADB106) sau NaCI (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; diferențele semnificative între grupurile de control și grupurile DIO au fost marcate ca *, P 0,05; PBMC = celulă mononucleară din sânge periferic.
43 Rezultate ale limfocitelor B După o scurtă stimulare a celulelor tumorale de 15 minute, comparația numărului de celule limfocitare B nu a evidențiat diferențe semnificative între grupurile individuale (Fig. 19). Limfocite B (% din PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 19: Evaluarea cantitativă a limfocitelor B la șobolanii F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dieta de control (Ko) și la 15 minute după celula tumorală MADB106 -Injectie (MADB106) sau NaCl (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = Limfocite T cu celule mononucleare din sânge periferic După o scurtă stimulare a celulelor tumorale de 15 minute, comparația numărului de celule limfocitare T nu a evidențiat diferențe semnificative între grupurile individuale (FIG. 20). Limfocite T (% din PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 20: Evaluarea cantitativă a limfocitelor T la șobolani F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dietă de control (Ko) și la 15 minute după celula tumorală MADB106 -Injectie (MADB106) sau NaCl (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = celulă mononucleară din sânge periferic.
44 Rezultate Celule T citotoxice (CD8 +) După o scurtă stimulare a celulelor tumorale de 15 minute, nu au existat diferențe semnificative între grupurile individuale în ceea ce privește numărul de celule al celulelor T citotoxice (CD8 +) (Fig. 21). 45 Celule T citotoxice (% din limfocitele T) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 21: Evaluarea cantitativă a celulelor T citotoxice (CD8 +) la șobolani F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dietă de control (Ko ) și la 15 minute după injecția cu celule tumorale MADB106 (MADB106) sau NaCI (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = Celule T helper de celule mononucleare din sânge periferic (CD4 +) Nu au existat diferențe semnificative între grupurile individuale atunci când se compară numărul de celule T helper (limfocite T CD4 +) după o scurtă stimulare a celulelor tumorale de 15 minute (Fig. 22 ). 75 celule T helper (% din limfocite T) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 22: Evaluarea cantitativă a celulelor T helper (CD4 +) la șobolani F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dietă de control (Ko) și 15 min după injecția cu celule tumorale MADB106 (MADB106) sau NaCI (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = celulă mononucleară din sânge periferic.
45 Rezultate Monocite Au existat diferențe semnificative la compararea numărului de celule monocite ale animalelor martor cu greutate normală și obezi care au fost injectate cu NaCl. În comparație cu animalele de control obeze, animalele de control cu greutate normală au avut un număr semnificativ mai mare de monocite, pe baza PBMC-urilor din sângele periferic. Compararea animalelor tumorale cu greutate normală și obeză, precum și compararea grupurilor DIO și de control, nu au evidențiat diferențe semnificative (Fig. 23). Monocite (% din PBMC) KoNaCl * DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 23: Evaluarea cantitativă a monocitelor la șobolanii F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dietă de control (Ko) și la 15 minute după injecția cu celule tumorale MADB106 ( MADB106) sau NaCI (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; diferențe semnificative între grupurile indicate de *, P 0,05; PBMC = celulă mononucleară din sânge periferic.
46 Rezultatele FACS - măsurători în celulele NK experimentate pe termen lung La compararea procentului de celule NK în PBMC trei săptămâni după injecția MADB106, nu au existat diferențe semnificative între grupurile individuale (Fig. 24). 4 celule NK% din PBMCs KoNaCl KoMADB106 DIONaCl DIOMADB106 Figura 24: Evaluarea cantitativă a numărului de celule NK la șobolanii F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dieta de control (Ko) și la trei săptămâni după numărul de celule tumorale MADB106 Injecție (MADB106) sau NaCI (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = Limfocite B cu celule mononucleare din sânge periferic Chiar și la trei săptămâni după injectarea celulei MADB106, evaluarea numărului de celule limfocitare B nu a relevat diferențe relevante între grupurile individuale (Fig. 25). Limfocite B (% din PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 25: Evaluarea cantitativă a limfocitelor B la șobolani F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dietă de control (Ko) și la trei săptămâni după celula tumorală MADB106 -Injectie (MADB106) sau NaCl (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = celulă mononucleară din sânge periferic.
47 Rezultate Limfocite T La trei săptămâni după injectarea celulelor tumorale, nu au existat diferențe semnificative între grupurile individuale în ceea ce privește procentul de limfocite T în PBMC (Fig. 26). Limfocite T (% din PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 26: Evaluarea cantitativă a limfocitelor T la șobolanii F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dieta de control (Ko) și la trei săptămâni după celula tumorală MADB106 -Injectie (MADB106) sau NaCl (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = Celule T citotoxice (CD8 +) cu celule mononucleare din sânge periferic Evaluarea numărului de celule ale celulelor T citotoxice (CD8 +) după 3 săptămâni de creștere a tumorii nu a relevat diferențe semnificative între grupurile individuale (Fig. 27). 45 Celule T citotoxice (% din limfocite T) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 27: Evaluarea cantitativă a celulelor T citotoxice (CD8 +) la șobolani F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dietă de control (Ko ) și la trei săptămâni după injecția cu celule tumorale MADB106 (MADB106) sau NaCl (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = celulă mononucleară din sânge periferic.
48 Rezultate Celule T helper (CD4 +) Compararea numărului de celule al celulelor T helper (CD4 +) după 3 săptămâni de creștere a tumorii nu a relevat diferențe relevante între grupurile individuale (Fig. 28). 70 celule T-helper (% din limfocite T) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 28: Evaluarea cantitativă a celulelor T-helper (CD4 +) la șobolani F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dietă de control (Ko) și la trei săptămâni după injecția cu celule tumorale MADB106 (MADB106) sau NaCI (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = Monocite cu celule mononucleare din sânge periferic După 3 săptămâni de creștere a tumorii, comparația numărului de monocite nu a relevat diferențe semnificative între grupurile individuale (Fig. 29). Monocite (% din PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Figura 29: Evaluarea cantitativă a monocitelor la șobolani F344 masculi hrăniți cu obezitate indusă de dietă (DIO) sau dietă de control (Ko) și la trei săptămâni după injectarea celulelor tumorale MADB106 (MADB106 ) sau NaCI (n = 8); sunt afișate valorile medii ± SEM; PBMC = celulă mononucleară din sânge periferic.