Vizualizarea Candida albicans în tractul gastrointestinal murin folosind fluorescente in situ
rezumat
Scopul acestui protocol este de a vizualiza forma și localizarea celulelor Candida albicans în tractul gastro-intestinal al mamiferelor.
Abstract
Candida albicans este o componentă fungică a microbiotei intestinale la om și la multe alte mamifere. Deși C. albicans nu provoacă simptome la majoritatea gazdelor colonizate, rezervorul comensal servește ca depozit pentru bolile infecțioase, iar prezența sânilor fungici cu conținut ridicat în intestin este asociată cu boala inflamatorie a intestinului. Aici, descriem o metodă de vizualizare a morfologiei și localizării celulelor C. albicans într-un model de șoarece de colonizare gastrointestinală stabilă. Colonizarea este stabilită utilizând o doză unică de C. albicans la animalele care au fost tratate cu antibiotice orale. Segmente de țesut intestinal sunt atașate într-un mod care păstrează arhitectura conținutului luminal (microorganisme și mucus), precum și mucoasa gazdă. În cele din urmă, hibridizarea fluorescentă in situ se efectuează folosind sonde împotriva ARNr fungic pentru a colora C. albicans și hife. Un avantaj cheie al acestui protocol este acela că permite observarea simultană a morfologiei celulare a C. albicans și asocierea sa spațială cu structurile gazdă în timpul colonizării gastrointestinale.
Introducere
Candida albicans este un fungic comensal, precum și un agent patogen uman oportunist. Această drojdie nu are o nișă de mediu definită și se răspândește în tractul gastrointestinal (GI), pielea și tractul genito-urinar al oamenilor și al altor mamifere 1. În timp ce cercetările timpurii asupra C. albicans s-au concentrat în primul rând pe potențialul său de virulență, mai multe rapoarte recente sugerează că răspândirea organismelor în intestin poate juca un rol important în sănătatea normală, inclusiv dezvoltarea imunitară a gazdei. 2, 3, 4. Pentru a facilita investigațiile comensalismului C. albicans în intestinul mamiferelor, am dezvoltat un model de șoarece de colonizare GI stabilă și o metodă de fluorescență in hibridizare in situ (FISH) pentru a vizualiza celulele fungice de drojdie și hifele în lumenul intestinal.
În acest articol, oferim instrucțiuni detaliate pentru stabilirea colonizării de înaltă calitate a C. albicans a tractului gastrointestinal al șoarecilor, pentru disecția tractului digestiv al animalelor eutanasiate, pentru atașarea țesuturilor într-un mod care păstrează luminalul pentru detectarea C. albicani în țesuturile gazdă folosind FISH. În plus față de tulpinile de tip sălbatic și mutante de C. albicans, tehnica de gavaj poate fi utilizată pentru a elibera alte microorganisme. Tehnica de fixare ar fi utilă pentru orice studiu în care se dorește conservarea conținutului intestinului. Procedura FISH poate fi finalizată într-o singură zi și poate fi utilizată pentru localizarea mai multor specii fungice folosind mai multe sonde etichetate diferit.
Protocol
Pașii descriși mai jos au fost aprobați de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor UCSF (IACUC).
1. Colonizarea gastrointestinală a șoarecilor cu C. albicans folosind gavaj oral
2. Pregătirea țesutului gastro-intestinal pentru histologie
NOTĂ: Această secțiune a protocolului este adaptată de la Johansson și Hansson 16 .
3. Validarea sondelor nou proiectate
NOTĂ: Următorul protocol pentru validarea sondelor C. albicans a fost adaptat de la Swidsinski și colab. 17 .
4. Colorarea PEȘTILOR în țesuturile tractului GI
Rezultate reprezentative
Urmând instrucțiunile furnizate, rezultatul acestei tehnici va fi marcarea fluorescentă a nucleelor din epiteliul gazdă, mucus și C. albicans în țesuturile gi tăiate. Celulele Candida albicans de tip sălbatic ar trebui să apară ca celule de drojdie rotunde, unicelulare sau hife multicelulare foarte alungite, uneori ramificate, (diviziunile celulare nu vor fi evidente în hife). Mutanții C. albicans pot apărea în plus ca drojdii „cenușii” mai mici și ușor alungite sau ca „GUT” mai mari și ușor alungite (tranziție indusă de gastro-intestinal) sau drojdii „opace”.
figura 1 arată acul de alimentare utilizat pentru gavajul oral, precum și pozițiile cheie ale acului în timpul procedurii de gavaj. Figura 2 oferă o configurație tipică utilizată pentru disecția organelor și apariția segmentelor gastrointestinale de șoarece.
Figura 3DE EXEMPLU descrie C. albicans în intestinul gros al șoarecilor, colorate cu sonda specifică C. albicans (Figura 3E) sau sonda panfunonală (Figura 3F, G). C. albicans apare roșu în aceste imagini, nucleele celulei gazdă sunt albastre, iar stratul de mucus este verde. Atât drojdiile rotunde, cât și hifele foarte alungite (vârfurile săgeții albe) apar în intestinul gros. Vă rugăm să rețineți că colorarea este mai strălucitoare cu sonda panfungus. Figura 3G reprezintă un mutant ume6 în același compartiment, colorat cu sonda panfunonică. Ume6 codifică un factor de transcripție care este necesar pentru formarea hifei în condiții in vitro 19. Interesant este că fenotipul de drojdie blocat afișat de acest mutant în condiții in vitro nu este recapitulat în intestin, sugerând că un factor redundant trebuie activat în gazda 12. Figura 4 reprezintă apariția tipurilor sălbatice de C. albicans în diferite segmente ale tractului gastrointestinal murin, inclusiv regiuni adiacente mucoasei gazdă și regiuni mai centrale ale lumenului intestinal.