Biochimie de purificare a proteinelor
Purificarea unei proteine este un proces care face mai mulți pași: extracție inițială, precipitații diferențiale, dializă, cromatografii de diferite tipuri etc.
PRINCIPII TEORETICE
Etapele principale ale unei purificări
De obicei, mai întâi zdrobim materialul din care dorim să extragem proteina (țesut animal, parte din plante, bacterii etc.). În acest scop pot fi utilizate diverse dispozitive („Waring Blender”, dispozitiv Potter-Eveljhem, „Polytron” etc.). Această omogenizare are loc într-un tampon cu compoziție adecvată. Acest pas este evident primul.
Apoi sunt folosite diverse tehnici pentru a separa proteina dorită de toate celelalte prezente. De obicei, primii pași nu sunt tehnici foarte specifice, dar sunt potrivite pentru a gestiona volume mari. Apoi, pe măsură ce pașii continuă, sunt folosite tehnici din ce în ce mai specifice, care sunt adesea aplicabile preparatelor cu volum redus.
Una dintre metodele cele mai potrivite pentru volumele mari este precipitarea diferențială a sulfatului de amoniu. Acesta este motivul pentru care este foarte des utilizat imediat după omogenizare pentru a scăpa de cea mai mare parte a contaminanților.
Cromatografiile cu schimb de ioni sau cromatografiile de afinitate, aplicabile la volume bune de eșantioane, dar având o putere de separare destul de bună, sunt metode intermediare bune.
În cele din urmă, se utilizează adesea sitarea moleculară sau izofocarea, care permite rafinarea purității, dar necesită volume foarte mici de proteine concentrate.
Adesea, între acești pași, este necesar să se îndepărteze sărurile sau produsele utilizate în aceste cromatografii. Apoi se folosește dializa sau ultrafiltrarea. Dacă trebuie să concentrăm preparatul, acesta este liofilizat. Dacă doriți să evitați aceste proceduri, trebuie să alegeți metode care nu sunt afectate negativ de aceste produse.
Testul proteinelor și testul activității proteinelor
Toți acești pași ar trebui urmați îndeaproape pentru a verifica dacă tehnicile funcționează bine. Pentru aceasta, este foarte obișnuit să se măsoare proteina de purificat după fiecare etapă. Prin urmare, este necesar să existe o metodă de testare (enzimatică, imunologică, biologică etc.) pentru a urma procesul. De asemenea, măsurăm cantitatea totală de proteine. Această ultimă valoare va fi utilizată pentru a calcula activitatea specifică (vezi tabelul de purificare)
În cazul în care aceasta este prima dată când proteina este izolată, va fi necesar să se dezvolte metoda de testare chiar înainte de a dezvolta metoda de purificare.
Tabel de purificare și criterii de puritate
Pe parcursul tuturor acestor pași, este esențial să se evalueze cei doi factori cheie, puritatea și randamentul. Randamentul (cantitatea de proteină obținută) poate fi ușor măsurat prin test enzimatic, RIA etc. Un tabel de purificare (a se vedea secțiunea „calcule”) este, de asemenea, un instrument foarte util în acest scop. Dacă se constată că una dintre etapele de purificare determină o pierdere substanțială a activității sau a cantității de proteină, trebuie să ne punem la îndoială utilitatea sau calitatea performanței sale. Activitatea specifică este o măsură cantitativă a purității preparatului. Din nou, dacă observăm că un pas nu permite creșterea purității, atunci trebuie să punem la îndoială relevanța sa. Pentru a putea calcula randamentul și purificarea, nu uitați să măsurați volumul total al fracției obținute după fiecare etapă și să luați probe din aceasta, care vor face posibilă determinarea proteinelor totale și a cantității de proteine qu ' încercăm să ne izolăm.
Puritatea unui preparat proteic poate fi de asemenea evaluată în conformitate cu criterii calitative. Astfel, poate fi vizualizat cu ușurință calitativ prin electroforeză de înaltă rezoluție sau focalizare izoelectrică. Dacă se vede o singură bandă proteică, se poate concluziona că preparatul conține o singură proteină. Această evaluare calitativă poate fi totuși distorsionată dacă proteina este contaminată de una sau mai multe altele de aceeași mobilitate în condițiile de electroforeză sau de focalizare. Aceste tehnici fac, de asemenea, posibilă urmărirea purificării și pentru a vedea dacă numărul proteinelor contaminante scade pe măsură ce procesul progresează pentru a se încheia, în mod ideal, cu o singură specie de proteină.
METODOLOGIE ȘI APARAT
În timpul tuturor acestor pași, este evident necesar să evitați denaturarea proteinei pe care doriți să o izolați. Prin urmare, este necesar să se utilizeze medii ale căror caracteristici sunt compatibile cu stabilitatea proteinelor (pH, rezistență ionică, osmolaritate, săruri, antioxidanți etc.). Pentru aceasta, se produc anumite medii mai mult sau mai puțin „fiziologice”, cum ar fi PBS sau soluție salină, care au unele dintre aceste proprietăți. Astfel, soluția salină (150 mM NaCl sau 0,85%) are o osmolaritate aproape fiziologică de 300 mOs. Adesea se utilizează un tampon pentru menținerea pH-ului (de obicei în jur de 7,4). PBS („soluție salină tamponată cu fosfat”) conține un tampon fosfat pH 7,4 și osmolaritatea sumei tuturor componentelor sale este de 315 mOs. Mediile fiziologice sunt discutate în secțiunea „soluții fiziologice” din SIITUB.
Pentru a menține pH-ul la un nivel adecvat, un produs tampon este în general inclus în soluții. Fosfatul (ca amestec mono- și dibazic) este utilizat în PBS. Trisul (trishidroxi-metil-aminometan) este foarte frecvent utilizat datorită costului redus, chiar dacă nu este foarte eficient la pH 7,4 și inhibă anumite reacții fiziologice. Hepes (hidroxietil-piperazin-etan-sulfat) este, de asemenea, adesea utilizat. Calitățile și defectele principalelor produse utilizate pentru tamponarea pH-ului în soluțiile fiziologice sunt discutate în secțiunea „pHmetrie” a SIITUB.
De asemenea, este important să se evite denaturarea proteinelor prin expunerea lor la aer sau prin spumarea acestora, ceea ce determină denaturarea și favorizează oxidarea. Acesta este în special cazul oxidării funcției tiol a cisteinelor în cistine, adică formarea unei legături disulfidice. Proteinele citoplasmatice sunt deosebit de sensibile, deoarece mediul lor natural, citosolul, este ușor reducător. Prin urmare, nu rezistă solubilizării lor în mediul ambiant care este oxidant. Utilizarea de antioxidanți precum β-mercapto-etanolul sau unul dintre reactivii Cleland, ditiotreitol sau ditiotreitreol, este adesea recomandată pentru a proteja aceste proteine. Proteinele compartimentelor extracelulare (sânge, lichid cefalorahidian etc.) sunt mult mai puțin susceptibile la această problemă, deoarece sunt medii ușor oxidante. Proteinele acestor compartimente nu conțin sau foarte puțini tioli liberi, ci mai degrabă legături disulfurice.