Livrarea și transfecția terapeutică a genelor în celulele cancerului pancreatic uman folosind creșterea epidermică
rezumat
Sistemul nanovector de inginerie bazat pe gelatină de tip B (SREG) a fost dezvoltat pentru livrarea sistemică a genelor și transfecția în tratamentul cancerului pancreatic. Prin modificarea peptidei specifice receptorilor factorului de creștere epidermic (EGFR) de pe suprafața nanparticulelor, aceștia ar putea viza receptorul EGFR și ar putea elibera plasmida sub reducerea mediului, cum ar fi concentrații mari de glutation intracelular.
Abstract
Peste 32.000 de pacienți sunt diagnosticați cu cancer pancreatic în Statele Unite pe an, iar boala este asociată cu o mortalitate foarte mare 1. Există o nevoie urgentă de a dezvolta noi strategii terapeutice care pot fi traduse clinic, care pot îmbunătăți statisticile de supraviețuire a pacientului cancer pancreatic. Deși terapia genică în cancer a arătat o promisiune enormă, provocarea majoră constă în dezvoltarea unui sistem de livrare sigur și eficient, care poate duce la exprimarea transgenică susținută.
Majoritatea terapiilor genetice antitumorale se concentrează pe administrarea genelor supresoare tumorale, cum ar fi p53 de tip sălbatic (WT-p53), pentru a restabili funcția pro-apoptotică în celule 9. Mecanismul p53 funcționează ca un mediu esențial de semnalizare în creșterea celulară, care reglează apoptoza, oprirea ciclului celular, metabolismul și alte procese 10. În cancerul pancreatic, majoritatea celulelor au mutații în proteina p53, provocând pierderea activității apoptotice. Odată cu introducerea greutăților p53, apoptoza ar putea fi reparată și va declanșa moartea celulelor în alte celule canceroase.
Pe baza raționamentului de mai sus, am proiectat nanoparticule de gelatină tiolată modificate peptidice EGFR pentru livrarea genei p53 și eficiența în greutate a livrării și transfecției evaluate a celulelor Panc-1.
Protocol
1. Pregătirea nanoparticulelor de gelatină vizate de ADN plasmidic încapsulat EGFR
2. Caracterizarea nanoparticulelor EGFR țintite
3. În studii de transfecție in vitro cu celule de cancer pancreatic Panc-1
4. Rezultate reprezentative
1. Sinteza și chatacterizarea nanoparticulelor EGFR țintite
Nanoparticulele peptidice modificate EGFR au fost sintetizate ca schema prezentată în Figura 1. Nanoparticulele preparate prin desolvatare au fost caracterizate pentru dimensiunea particulelor și potențialul zeta. Dimensiunea medie a sarcinii și aria particulelor preparate din gelatine tiolate cu diferite grade de tiolare sunt enumerate în Tabelul 1. Particulele cu diametrul mediu ale diferitelor nanoparticule au fost între 150-250 nm. Nanoparticulele tiolate au dimensiuni mai mici comparativ cu nanoparticulele din gelatină, posibil datorită lipirii disulfurii în interiorul particulelor. Cu diferite modificări ale suprafeței, dimensiunile nanoparticulelor au crescut. Potențialele zeta ale diferitelor formulări au fost în jur de -20 mV. Cu analiza SEM, s-au observat dimensiunea, morfologia suprafeței și forma sferică a nanoparticulelor și corespunzătoare suitei Zetasizer. Eficiența de încărcare a ADN-ului în nanoparticulele de gelatină și nanoparticulele de gelatină tiol au fost mai mari de 95% (Tabelul 1).
Caracterizarea nanoparticulelor
| Formulare | Diametrul nanoparticulelor (nm) | Potențial Zeta (mV) | Eficiența încărcării ADN-ului plasmidic (%) |
| Gel NP | 151,4 ± 23,5 | -17,1 ± 5,23 | 95,6 ± 2,2 |
| SH-Gel NP | 132,6 ± 17,9 | -24,6 ± 5,16 | 97,0 ± 3,8 |
| SH-Gel-PEG | 179,0 ± 30,9 | -22,3 ± 9,50 | 95,8 ± 6,5 |
| Peptidă SH-Gel PEG | 230,8 ± 41,5 | -18,1 ± 4,02 | 94,8 ± 5,1 |
Tables 1. dimensiunea particulelor, încărcarea suprafeței și încapsularea ADN-ului plasmidic controlează eficiența și nanoparticulele de gelatină și tiolină de gelatină EGFR.
Scanări de spectroscopie electronică C 1S de înaltă rezoluție pentru analize chimice (ESCA) au fost utilizate pentru a analiza componentele de suprafață ale gelatinei tiolate (SH-Gel NP), ale gelatinei tiolate modificate PEG (SH-Gel PEG) și ale peptidei EGFR nanoparticulele de gelatină modificate cu tiol (Peptida SH-Gel PEG). Rezultatele din Tabelul 2 arată intensitățile maxime ale grupărilor CH (hidrocarburi), CO (eter) și C = O (carbonil) la 285,0, 286,3, 288,1 și, respectiv, eV. Semnalul CO eteric a crescut după modificare și PEG a scăzut după conjugarea peptidelor. În timp ce compoziția de azot a scăzut după modificare și PEG a crescut după modificarea peptidelor, ceea ce a confirmat prezența peptidei EGFR care vizează nanoparticulele. Analiza ESCA a confirmat în continuare modificarea suprafeței PEG și a peptidelor.
Spectroscopie electronică pentru analiza chimică a suprafeței nanoparticulelor de compoziție
| Formulare | C 1s (%) | O 1s (%) | N 1s (%) |
| SH-Gel NP | 59,3 ± 0,8 | 22,9 ± 0,5 | 12,9 ± 0,1 |
| SH-Gel-PEG | 58,2 ± 0,6 | 28,0 ± 1,2 | 9,5 ± 0,7 |
| Peptidă SH-Gel PEG | 56,7 ± 0,8 | 25,9 ± 0,7 | 12,3 ± 0,6 |
| Formulare | CC (%) | CO, N (%) | C = O (%) |
| SH-Gel NP | 51,5 | 26.6 | 21.9 |
| SH-Gel-PEG | 17.1 | 63.1 | 19.8 |
| Peptidă SH-Gel PEG | 33.1 | 42,8 | 24.1 |
masa 2. Scanări de spectroscopie electronică de înaltă rezoluție C 1S pentru analiză chimică (ESCA)