PDF INVESTIGAȚII PRIVIND METABOLISMUL GLUCOZEI - Descărcare gratuită PDF
Scurta descriere
1 55 INVESTIGAȚII PRIVIND METABOLISMUL GLUCOZEI A. BAZE BIOCHIMICE La persoanele sănătoase, nivelul glicemiei este.
Descriere
EXAMENE A METABOLISMULUI GLUCOZEI A.
Bolile cronice ale ficatului apar sau sunt cauzate de predominanța hormonilor contrainsulari (de exemplu, în acromegalie, boala Cushing, feocromocitom). Formele primare ale diabetului sunt împărțite în două grupe principale, și anume diabetul de tip I, așa-numitul diabet juvenil, a cărui cauză este acum presupusă a fi factori imunologici care duc la distrugerea celulelor B și, astfel, la deficit de insulină, pe de altă parte, II Diabet (diabet cu debut la adulți), pentru care sunt decisive alte mecanisme, parțial încă necunoscute. De regulă, acest lucru nu are ca rezultat o lipsă de insulină, ci mai degrabă un efect de insulină redus, de ex. prin lipsa receptorilor de insulină. În special cu diabetul de tip II, care poate progresa lent pe o perioadă mai lungă de timp și, astfel, poate rămâne nedetectat, progresia bolii poate fi prevenită dacă sunt tratați factorii de risc obezitate, tulburări ale metabolismului lipidelor, inactivitatea fizică și predominanța hormonilor anti-insulinici. Testul de toleranță la glucoză efectuat în stagiu joacă un rol important în detectare.
În diabetul de tip I, testele de screening imunologic (pentru anticorpi împotriva părților celulelor insulelor) vor juca un rol mai mare în viitor, deoarece apar cu mult înainte de debutul bolii, care este de obicei bruscă pentru pacient. Cu toate acestea, în acest moment, 80% din celulele insulelor sunt de obicei deja distruse. Este
Menținerea constantă a nivelului de glucoză din sânge printr-un control metabolic strict (insulină, dietă, exerciții fizice) pentru a întârzia boli secundare precum arterioscleroza, orbirea, afectarea rinichilor, gangrena și neuropatiile. Determinarea hemoglobinei glicozilate efectuată în stagiu este un ajutor important în acest sens. Pacienții care suferă de diabet necontrolat au adesea concentrații mari de glucoză în sânge în plasmă. Acest lucru duce la concentrații crescute de hemoglobină glicată în eritrocite. Eritrocitele de la indivizi sănătoși cu nivel normal de glucoză din sânge conțin 4-7% din hemoglobina totală a acestora sub formă glicozilată. La diabeticii slab sau slab controlați, această valoare poate ajunge la 18-20%. Determinarea hemoglobinei glicozilate permite o observare pe termen lung a nivelului de glucoză din sânge. Odată modificată, hemoglobina rămâne în fluxul sanguin atâta timp cât eritrocitul este viu (aproximativ 120 de zile). Un nivel crescut de hemoglobină glicată nu începe să scadă până la 5-6 săptămâni după ce nivelul de glucoză a fost ajustat și atinge intervalul normal după aproximativ 20 de săptămâni.
Indică concentrația de glucoză din sânge, concentrația hemoglobinei glicate reprezintă un fel de integrantă peste nivelul glicemiei timp de câteva săptămâni.
Testul de toleranță la glucoză În testul de toleranță la glucoză, nivelul de glucoză din sânge se măsoară peste 1,5 ore după expunerea orală la glucoză și evoluția sa în timp este comparată cu cea a unui colectiv standard. În plus față de acest test indirect al funcționalității celulelor B ale insulelor din Langerhans, evoluția concentrației de insulină în ser poate fi determinată, de asemenea, direct folosind tehnici imunologice complexe. Creșterea și scăderea concentrației de glucoză din sânge observate cu testul de toleranță la glucoză la persoanele sănătoase (colectiv normal) sau la diabetici este prezentată în Tabelul I. Diabetul zaharat asimptomatic este suspectat dacă se depășește valoarea maximă de 11,1 mmol/l așteptată după 30-60 de minute. Valoarea de 2 ore este diagnosticată mai valoroasă; dacă depășește 7,8 mmol/l, este vorba de diabet zaharat. În schimb, valorile maxime sub 8,9 mmol/l și valorile de două ore mai jos
6,7 mmol/l intervalul normal. Valorile din intervalul intermediar sunt suspecte și necesită verificare. La u. Pentru a nu pune în pericol pacienții diabetici cu un test de provocare, diabetul manifest este exclus în prealabil prin intermediul unui „profil zilnic al glicemiei”.
Evaluarea expunerii orale la glicemie după administrarea de glucoză Concentrația glicemiei în sângele capilar în mmol/l 0 '
Cu testul de toleranță la glucoză, pot fi detectate (și declanșate) hipoglicemia patologică de diferite cauze (hiperinsulinism funcțional; adenom cu celule insulare), în care valorile maxime după administrarea orală de glucoză rămân sub normă. Diabetul zaharat primar poate fi împărțit în patru etape: 1.
Diabet potențial: fără metabolism diabetic, teste de screening ale diabetului normal, dar sarcină familială; aproximativ 25% din populația noastră
Diabet latent: sub stres, sarcină sau supraponderalitate, testul de toleranță la glucoză poate fi, de asemenea, pozitiv.
Diabet asimptomatic („subclinic” sau „chimic”): test de toleranță la glucoză pozitiv; aproximativ 8% din populație.
Diabet clinic: diabet manifest; aproximativ 3% din populație. Hiperglicemie și posibil glucozurie. Nu sunt necesare teste de screening pentru diabet. În acest caz, testele pot pune în pericol pacientul!
Hemoglobina glicată Hemoglobina glicată este produsă prin adăugarea neenzimatică de glucoză la grupele amino de lizină din lanțul peptidic sau la capătul N-terminal al subunităților și . Un transportor de glucoză din membrana eritrocitară asigură un schimb rapid de glucoză, astfel încât aceeași concentrație de glucoză este prezentă în eritrocite ca și în plasmă. Aldozele reacționează cu grupări amino libere pentru a forma o bază Schiff. Prin rearanjarea Amadori, reziduul glicozilic este fixat ireversibil covalent în a doua etapă (Fig. 1).
Determinarea specifică a hemoglobinei glicate (HbA1) în hemolizat este posibilă după separarea prealabilă a fracțiunilor de hemoglobină prin cromatografie cu schimb de ioni. Acest proces de separare se bazează pe interacțiunea electrostatică a ionilor din eșantion care urmează să fie examinați cu un schimbător de ioni care conține grupuri de sarcină opusă, care sunt fixate covalent pe un material purtător insolubil (matrice). Contraioniștii care interacționează cu schimbătorul de ioni pot fi schimbați cu alți ioni cu aceeași sarcină. În funcție de încărcarea schimbătorului de ioni, schimbătoare de ioni),
Schimbătoare de ioni) cu sarcină negativă. Ca aproape toate proteinele, hemoglobina poartă o sarcină electrică în soluție apoasă, care este cauzată de grupările acide sau bazice ale lanțurilor laterale de aminoacizi, precum și de grupările terminalamino și -carboxil terminale. Sarcina netă a moleculei rezultă din suma sarcinilor individuale pozitive și negative și este dependentă de valoarea pH-ului soluției proteice. PH-ul la care se înregistrează numărul de încărcări pozitive ale celor ale
negativ și la care molecula apare neîncărcată spre exterior, se numește punctul izoelectric. Sub punctul izoelectric (IP), sarcina moleculei este pozitivă (cation) și, prin urmare, poate fi legată de un schimbător de cationi, în timp ce peste IP există o sarcină netă negativă (anion), care permite proteinei să se lege de un schimbător de anioni. Efectul electrostatic dintre proteină și schimbătorul de ioni poate fi slăbit sau chiar complet dizolvat prin schimbarea valorii pH-ului sau prin creșterea concentrației de sare (ioni competiționali). În acest experiment, un schimbător de cationi slab acid este utilizat pentru a separa diferitele sub-fracțiuni ale hemoglobinei. O alicotă a hemoglobinei este amestecată cu o suspensie de schimb ionic. În condițiile alese (pH = 7,0) numai hemoglobina normală este legată, în timp ce hemoglobina glicozilată (HbA1) rămâne în supernatant. Comportamentul diferit de adsorbție al celor două
glicozilată și hemoglobină normală, care este creată prin legarea ireversibilă a glucozei de o grupă amino a proteinei, în timp ce valoarea pH-ului rămâne neschimbată, a cărei sarcină totală este deplasată spre intervalul negativ și, astfel, forțele de legare dintre hemoglobina glicozilată și schimbătorul de ioni sunt reduse.
Întrebări generale metabolismul glucozei; Reglarea nivelului glicemiei; Efectul insulinei și al antagoniștilor insulinei; Chimia hormonilor menționați; Modificări metabolice ale diabetului zaharat; Hemoglobină (structură, funcție, curbă de legare a oxigenului, efect Bohr, efect tampon, modificări patologice: hemoglobinopatii cantitative și calitative, hemoglobină cu celule secera); Mioglobina.
SCOPUL EXPERIMENTELOR
Test de toleranță la glucoză După ce persoana testată a luat o cantitate definită de glucoză pe cale orală, concentrația de glucoză din sânge crește rapid - după ce glucoza este resorbită din lumenul intestinal. Concentrația de glucoză din sânge revine la normal într-un anumit timp după începerea exercițiului. Acest proces trebuie urmat prin determinarea concentrației de glucoză din sângele capilar. Creșterea și scăderea observate a concentrației de glucoză din sânge trebuie prezentate grafic și apoi interpretate.
Hemoglobina glicată mor
set de reactivi disponibil comercial care conține o suspensie gata de utilizare a unui schimbător de cationi slab acid. Scopul este de a determina cantitatea de hemoglobină glicată în propriul sânge, precum și într-o probă cu o valoare crescută (sânge diabetic).
PROCEDURA DE ÎNCERCARE ȘI PROTOCOLUL DE ÎNCERCARE
Aduceți lista: smock, calculator
Pregătiți cinci tuburi Eppendorf cu 0,5 ml acid percloric (0,35 mol/l) fiecare. După 30, 60 și 90 de minute, 0,05 ml de sânge capilar se îndepărtează de la vârful degetului folosind o pipetă capilară și capilarul este plasat în tuburile Eppendorf cu acid percloric și se agită bine (deproteinizare!). După ce a luat 0,05 ml de sânge capilar pentru a determina valoarea glicemiei la jeun (proba 1), persoana testată bea o soluție de 75 g de glucoză în 300 ml de suc. Ora este înregistrată. La 10 minute după ce ultima probă a fost îndepărtată și deproteinizată cu acid percloric, este centrifugată timp de 4 minute la viteza maximă. Supernatantele sunt decantate cu atenție, transferate în noi tuburi Eppendorf și centrifugate din nou timp de 4 minute. Supernatanții sunt utilizați pentru determinarea glicemiei (secțiunea C.3.). Vă rugăm să etichetați vasele cu numărul grupului și numărul eșantionului și predați restul probelor asistentului după test!
Reactiv de glucoză: Glucoza oxidază (DIO) oxidează glucoza în acid gluconic cu formarea de H2O2. Peroxidul de hidrogen oxidează donatorul de hidrogen (fenol și 4-aminofenazonă) la un colorant D într-o reacție catalizată de peroxidază (POD):
DUMNEZEU glucoză + H2O + O2 acid acid gluconic + H2O2
Cantitatea de colorant D formată este o măsură a cantității de glucoză convertită. Deoarece coeficientul de extincție molar al lui D depinde de condițiile de testare, extincția măsurată (lungimea de undă 500 nm) este legată de dispariția unei valori standard a glucozei.
Efectuarea determinării glicemiei
Soluțiile necesare sunt pe masa de lucru: I:
Reactiv de glucoză tampon fosfat, 0,10 mol/l, pH = 7,0; 50 ug crogen (0,75 mmol/l fenol și 0,25 mmol/l 4-aminofenazonă); > 1,5 KU/l POD; > 15 KU/l DUMNEZEU; > 2,0 KU/l mutarotază
Glucoza standard (5,55 mmol/l).
Se diluează 50 ul din nivelul glucozei în 0,5 ml acid percloric. Folosind probele preparate (secțiunea C.1.), Pregătiți loturile conform tabelului următor, amestecați bine și lăsați să stea 10 minute la temperatura camerei.
Calibrați fotometrul la 500 nm, determinați absorbanța standardului și probele în raport cu valoarea necompletată.
Hemoglobina glicată 1.
Luarea de sânge și pregătirea hemolizatului: plasați 200 pl de reactiv de hemoliză într-un vas Eppendorf (Eppi) marcat cu un „E”; Se colectează sângele cu o pipetă capilară de 50 µl; Adăugați imediat capilarul umplut în Eppi și amestecați bine, astfel încât sângele să fie curățat; Lasati sa stea 5 minute.
Abordarea HbA1 Abordările sunt făcute în paralel cu hemolizați din sânge standard (Eppi "S"), sânge autolog (Eppi "E") și sânge diabetic (Eppi "D"). Agitați puternic hemolizatul înainte de pipetare! Pipetați 100 pl hemolizat în fiecare dintre tuburile de schimb ionic; Etichetați tuburile („S”, „E” sau „D”) și introduceți separatoare (lăsați aproximativ 1 cm deasupra lichidului); Se incubează 5 minute și se agită energic la intervale de un minut; Strângeți cu grijă lichidul cu separatorul și măsurați absorbanța [Punctul 4 (E1)].
Lot total Hb În trei loturi paralele, 20 μl de hemolizat "S", "E" sau "D" sunt plasate într-o eprubetă cu 5 ml de apă distilată. amestecat. (Nu uitați de litere)! Lăsați să stea 5 minute și apoi măsurați absorbanța [Punctul 4 (EG)]
Măsurarea extincției probelor de sânge la = 405 nm (fotometrul este ajustat în funcție de apă).
Test de toleranță la glucoză (desfășurarea experimentului) Versiune scurtă Efectuați imediat punctele 1-4, apoi citiți mai departe ! Experiment 1 1) 2) 3) 4)
Adăugați 500 pl acid percloric la 4 Eppis (etichetat 0,30, 60,90 min.) Și extrageți sânge. Folosiți un capilar pentru aceasta. (Capilarul trebuie să fie plin, fără bule de aer) Aruncați capilarul în vasul marcat cu „0 min” și agitați imediat bine. Bea cola, notează timpul.
Experimentul 2: Poate fi efectuat în orice moment (timpul de 30 sau 60 de minute de la experimentul 1 este adecvat).
Partea B) 21) Umpleți câte trei eprubete fiecare cu 5 ml de apă (etichetate „E”, „S”, „D”) 22) Din Eppis („E”, „S”, „D”) câte 20 µl de hemolizat fiecare în eprubetele umplute cu apă
da. 23) Se amestecă bine și se lasă să stea 5 minute. 24) Măsurați din nou absorbanța împotriva apei la 405 nm.
După curățare, nu aruncați tuburile standard de glucoză, reactiv de glucoză și reactiv de hemoliză. Toate celelalte vase de eșantionare sunt eliminate în vasele de deșeuri de sânge furnizate.
EVALUARE ȘI DISCUȚIE DE EROARE
Test de toleranță la glucoză Introduceți absorbanta măsurată și rezultatele determinării glucozei în tabelul următor și trageți curba. Cum interpretați rezultatele?
ConcentrationE500 concentrația glicemiei (mmol/l)
Concentrația glicemiei se calculează după cum urmează:
Hemoglobina glicolizată Introduceți absorbanța măsurată în tabelul următor, determinați factorul F și calculați procentul fracției HbA1 din hemoglobina totală a sângelui autolog și diabetic. Proporția HbA1 din sângele standard este de 6,8%.